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1. 概述
PuriMagTM G-Ts磁性纳米微粒是均一的、聚合物包覆的超顺磁纳米粒，亲水表面确保磁珠在各种缓冲液中具有出色的分散性、低非特异吸附和易操作性，表面涂有高密度甲苯磺酰基活性基团，可以在不使用偶联剂的情况下，共价固定包含-NH2或-SH基团的配体进行生物分离。由于疏水的甲苯磺酰基通过偶联反应而被消除，因此珠的表面变为亲水性的。这种化学方法使配体能够保持其高活性功能，并在细胞和细菌破碎液中获得高收率和低的非特异性结合生物分离，这是快速免疫测定中的固相，用于分子应用或噬菌体展示文库的筛选。对特定靶蛋白（例如标记、受体、酶）具有亲和力的配体蛋白也可以与PuriMagTM G-Ts磁珠进行表面偶联。
特点与优势
w 预先激活并可以使用；
w 推荐的偶联条件：在37°C时pH 7.5~9.5高效；
w 偶联后表面没有电荷；
w 稳定的共价键，配体泄漏最少；
w 低非特异性结合；
w 1~20 mg蛋白质或0.1~2mg肽/ g磁珠
w 应用：细胞分选，免疫沉淀，抗体纯化，蛋白质/肽，DNA / RNA；
PuriMagTM G-Ts磁珠偶联机理：
2. 产品信息
Product Specifications
Description
Polymer coated Fe3O4 nanoparticles
Particle Size
200 nm
Number of Beads
~1.7×1010 beads/mg
Matrix
Proprietary polymer
Functional group
Tosyl group
Group density
~300 µmole / g of Beads
Magnetization
60~70 EMU/g
Formulation
10mg/mL in 1mM HCl
Stability
pH 3.5~10, 4~80 ℃, most organic solvents
Storage
1 year at 2~8 ℃. Do not freeze.
3. 使用方法
注意：
1）配体必须不含竞争性配体，例如蛋白质、糖或稳定剂。
2）添加硫酸铵（缓冲液C）至终浓度1.0–1.5 M将增加与磁珠偶联的抗体量。
3）在37°C下12~18小时后，配体与磁珠的最大共价结合。 20°C偶联需要更长的孵育时间（> 20小时）才能达到相同程度的化学结合。在4°C下，化学结合非常缓慢（> 48小时）。建议在低温下使用缓冲液A。
A. 所需材料
1）缓冲液A，B和C用于预清洗和偶联PuriMagTM G-Ts磁珠。pH稳定的配体，建议使用缓冲液A进行耦合。对于pH不稳定的配体，请使用缓冲液B。
2）请勿向这些缓冲液中添加任何蛋白质（除了特定的蛋白质配体之外）、糖等。
3）缓冲液D和E用于洗涤所有配体偶联的磁珠。缓冲液E也可用于储存配体偶联的磁珠。请勿使用任何含有蛋白质或氨基的缓冲液（例如甘氨酸、Tris）进行预洗或偶联至这些磁珠。如果BSA干扰您的下游应用，请用另一种蛋白质（例如HSA）或表面活性剂（例如Tween 20）代替它。建议使用蛋白质阻断剂，因为它可以减少聚集和非特异性结合。
3）如果偶联的磁珠需要防腐剂，可以将最终浓度<0.1％（w / v）的NaN3添加到缓冲液E中。
注意：叠氮化钠可能与铅和铜管反应生成高度爆炸性的金属叠氮化物。
4）缓冲液
Buffer A (0.1 M borate buffer pH 9.5): 6.18 g H3BO3 (MW 61.83). Dissolve in 800 mL distilled water. Adjust pH to9.5 using 5M NaOH and adjust volume to 1 L with distilled water.
Buffer B (0.1 M Na-phosphate buffer, pH 7.4): 2.62 g NaH2PO4 × H2O (MW 137.99) and 14.42 g Na2HPO4 × 2 H2O (MW177.99). Adjust volume to 1 L with distilled water.
Buffer C (3 M ammonium sulphate in Buffer A or B): 39.64 g (NH4)2SO4 dissolved in Buffer A or B. Adjust pH with NaOH or HCl. Adjust up to 100 mL with Buffer A or B.
Buffer D (PBS pH 7.4 with 0.5% (w/v) BSA): Add 0.88 g NaCl (MW 58.4) and 0.5% (w/v) BSA to 80 mL 0.01 M sodium phosphate pH 7.4. Mix thoroughly and adjust volume to 100 mL with 0.01 M sodium-phosphate pH 7.4.
Buffer E (PBS pH 7.4 with 0.1% (w/v) BSA): Add 0.88 g NaCl (MW 58.4) and 0.1% (w/v) BSA to 80 mL 0.01 M sodium phosphate pH 7.4. Mix thoroughly and adjust volume to 100 mL with 0.01 M sodium-phosphate pH 7.4.
B. 偶联方案
B-1、清洗磁珠
1）将PuriMagTM磁珠重悬在样品瓶中（即涡旋> 30 s，或倾斜并旋转5分钟）。
2）将所需体积的磁珠转移到离心管中。
3）加入相同体积的缓冲液A或B，或至少加入1 mL，然后重悬。
4）将离心管放在磁力架上，弃去上清液。
5）从磁力架上移开试管，然后将洗涤后的磁珠重新悬浮在与磁珠初始体积相同的缓冲液A或B中（步骤2）。
B-2、将配体与PuriMagTM磁珠偶联
该方案基于2.5 mg（〜250μL）磁珠。对于大于10 mg磁珠的体积，请相应地按比例放大所有体积。
使用50μg配体/ mg磁珠。
最佳偶联浓度为〜2.5 mg磁珠/ mL，以实现有效混合。
1) 将250μL洗涤并重悬的珠子转移至新离心管中，置于磁力架上以除去上清液。
2) 将磁珠重悬于100μg配体中，并添加缓冲液A（或B），使总体积为150μL。通过涡旋或移液彻底混合。
3) 加入100μL缓冲液C，通过移液混合。
4) 在37°C的旋转孵育12~18小时。
5) 将离心管放在磁力架上以除去上清液。
6) 从磁力架上移开离心管，加入1 mL缓冲液D，在37°C混悬孵育1小时。
7) 将离心管放在磁力架上以除去上清液。
8) 从磁力架上移离心管，并加入1 mL Buffer E，涡旋5~10秒。
9) 将离心管放在磁力架上以除去上清液。
10) 重复步骤7–8。
11) 重悬并稀释缓冲液E中的磁珠，以达到最终所需的磁珠浓度。
B-3、分离靶蛋白
1 mg偶联的磁珠通常结合1~ 20μg靶蛋白，但因应用而异。因此，需要优化。如果目标蛋白的浓度非常低，通常需要增加配体偶联珠的数量。该方案基于如上所述的1 mg配体偶联磁珠。
1) 将1~20 ug含目标蛋白的样品添加到100 uL的配体偶联磁珠中。
2) 倾斜孵育以捕获目标蛋白质。
3) 将离心管放在磁力架上2分钟（粘性样品需要更长的时间）。移去上清液。
4) 从磁力架移开试管，并加入1 mL 的Buffer D或E，涡旋振荡5-10秒。
6) 重复步骤4–5两次。
部分采用本磁珠文献：
1. 李亚男, 季伙燕, 王天一, 沈蕾, 施秀英, 王建新. 血清肌钙蛋白 I 液相色谱串联质谱法建立及优化，化学学报，2019, 77, 539—544 （PuriMag G-Ts 磁珠偶联抗体制备免疫磁珠对血清cTnI 进行富集.）
