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1. 概述
蛋白磷酸化参与多种细胞过程，约30%蛋白可实现磷酸化修饰。很多研究聚焦于蛋白的翻译后修饰。然而，因磷酸化肽丰度低、化学计量低和理化特性特殊等因素，导致长期以来蛋白质组尺度上的磷酸化研究都是蛋白质组学研究的一个重要挑战。因此，当前迫切需要能特异富集磷酸化肽、且与质谱分析兼容的富集技术。
二氧化钛具有富集磷酸丝氨酸（pSer）、磷酸苏氨酸（pThr）和磷酸酪氨酸（pTyr）残基的选择性亲和力。TiO2-功能性磁珠（PuriMag Si-TiO2）是一种专有的磁性材料微粒载体，能在复杂生物样品的蛋白消化物中简单、方便、高效、高特异、高重复性富集磷酸化肽。磁珠表面的二氧化钛纳米粒子对于单磷酸化肽和多磷酸化肽没有明显的偏好，因而非常适合单步富集磷酸化肽用于基于质谱的蛋白质组学分析。PuriMag Si-TiO2以其出色的特异性，超越竞争对手的产品，具有较高的磷酸化肽回收率。PuriMag Si-TiO2技术的优势如下：
l 对磷酸化肽高特异性；
l 对单磷酸化肽和多磷酸化肽无明显的偏好；
l 小于10s的快速磁响应性，减少样品损失，更适合自动化操作；
l 抗氧化特性，降低样品被污染风险。
2. 产品信息
名称
PuriMag Si-TiO2
用途
分离富集磷酸化肽
磁核
四氧化三铁
表面聚合物
二氧化硅
表面功能基团
二氧化钛（TiO2）
结合容量
>10 µg phosphopeptides /mg bead
尺寸
~400 nm
浓度
25 mg/ml，保存于20% 乙醇
稳定性
pH 2.5–12; 4–60℃
储存
4–8℃，避免冷冻
3. 结合和洗脱程序
上样缓冲液（Loading buffer）: 1 M glycolic acid in 80% acetonitrile (ACN) and 5% trifluoroacetic acid (TFA) ；
洗涤缓冲液（Wash buffer）: 80% ACN, 1% TFA ；
洗脱缓冲液（Elution buffer）: 1% NH4OH；
影响磷酸肽结合的因素包括：缓冲液的组成、pH值以及是否存在污染物/干扰化合物。磁珠使用量应根据应用进行优化，建议使用过量的含磷酸肽样品使磁珠饱和。
注意：为确保最佳性能，所有的试剂应为分析级新鲜配制。后续的操作流程所使用的缓冲液仅作为示例，并非限制。PuriMag Si-TiO2磁珠在磷酸肽富集过程中与一系列不同的缓冲液兼容。为达到最好的纯度和产量，应优化的具体富集过程的实验条件。
3.1 PuriMag Si-TiO2磁珠的平衡
PuriMag Si-TiO2磁珠以25 mg/ml浓度，保存于20% 乙醇中。使用前应对磁珠进行洗涤和平衡，可根据实际需要放大和缩小磁珠用量。最小体积为10微升的微粒悬浮液是确保磁珠能与缓冲液分离。以下方案是从约500μg的总蛋白质消化液中纯化磷酸肽。
1）涡旋混合PuriMag Si-TiO2磁珠以确保均匀分散。
2）转移40μl（1mg）PuriMag Si-TiO2磁珠到2ml离心管。
3）将离心管放在磁分离器上，放置30秒，移弃上清。
4）用200μl的70％乙醇温和洗涤微粒（例如间或涡旋混合）5分钟。
5）将离心管放在磁分离器上，放置30秒，移弃上清。
6）重复步骤4和5。
7）用100μl的1％NH4OH轻轻洗涤微粒（例如间或涡旋混合）10分钟。
8）将离心管放在磁分离器上，放置30秒，移弃上清。
9）50μl上样缓冲液平衡磁珠60秒。
10）将离心管放在磁分离器上，放置30秒，移弃上清。
11）重复第9步和第10步两次，共三次平衡。
13）除去上样缓冲液后，PuriMag Si-TiO2磁珠可用于结合目标磷酸肽。
3.2 磷酸肽富集过程
1) 用上样缓冲液调整消化后蛋白至合适浓度（包含~ 500µg总蛋白）与平衡好的PuriMag Si-TiO2磁珠相匹配。
注意：若磷酸肽为固体，请用不低于100µl的上样缓冲液溶解。
2) 涡旋或移液器吸打混匀磁珠。
3) 室温孵育20分钟，过程中确保样品和磁珠的混合悬浮。
4) 将离心管放在磁分离器上，放置30秒，移弃上清。
5) 100µl的上样缓冲液温和洗涤30秒，去除未结合的样品。
6) 将离心管放在磁分离器上，放置30秒，移弃上清。
7) 100 µl洗涤缓冲温和洗涤2分钟，去除非特异性结合的多肽。
8) 将离心管放在磁分离器上，放置30秒，移弃上清。
9) 重复第7步和第8步2次，共洗涤3次。
10) 使用溶液（10% ACN和0.2% TFA）额外洗涤两次。
11) 80µl洗脱缓冲液洗脱15分钟，确保洗脱过程中磁珠的悬浮和混合。
12) 重复第11步，再用80µl洗脱缓冲液洗脱两次。共获得240µl洗脱样品。为获得浓缩样品，可用3×40µl洗脱缓冲液用于洗脱过程。
13) 将离心管放在磁分离器上，放置30秒，移取上清到一新离心管。
14) 增在240µl洗脱液中加入60µl 10%甲酸（FA）酸化样本。
15) 用质谱分析样品。质谱分析前，可对样本脱盐（如C18），浓缩（如真空离心或冻干）。
4. 问题解决方法
问题
可能原因
解决方案
磷酸肽不结合磁珠
结合pH不合适
确保上样缓冲液pH为2.5-3.0
使用的磁珠太少
增加磁珠使用量
反应时间不够
增加孵育时间至30分钟
干扰物质阻碍结合
对样品进行脱盐或透析
非特异性结合
洗涤体积不够
增加洗脱体积
洗涤时间不够
增加洗脱时间
缓冲液配制有误
正确配制新鲜的缓冲液
磷酸化多肽回收率低
不正确的洗脱缓冲液浓度
确保洗脱缓冲液NH4OH高于0.5%
样品浓度过低
冷冻干燥或真空离心浓缩样品
样品中污染物导致的离子抑制
对制备的磷酸化多肽脱盐（如C18柱）
引用该产品文献：
1. Bin Luo, et al. Metal–Organic Framework-Derived Hollow and Hierarchical Porous Multivariate Metal-Oxide Microspheres for Efficient Phosphoproteomics Analysis, ACS Appl. Mater. Interfaces 2021, 13, 29, 34762–34772, https://doi.org/10.1021/acsami.1c10795 (TiO2磁珠富集磷酸化多肽)
2. Liu, Jun, et al. Direct analysis of metabolites in the liver tissue of zebrafish exposed to fiproles by internal extractive electrospray ionization mass spectrometry, Analyst, 2021, 146(14): 4480-4486，http://dx.doi.org/10.1039/D1AN00490E, （TiO2磁珠）
3. Binbin Wang, et al. Phosphonate-Functionalized Ionic Liquid: A New Surface Modifier Contributing to the Enhanced Enrichment of Phosphorylated Peptides, ACS Sustainable Chem. Eng. 2021, 9, 23, 7930–7940, https://doi.org/10.1021/acssuschemeng.1c02119 (TiO2磁珠)
4. Bin Luo, et al. Bifunctional magnetic covalent organic framework for simultaneous enrichment of phosphopeptides and glycopeptides, Analytica Chimica Acta, Volume 1177, 2021, 338761, https://doi.org/10.1016/j.aca.2021.338761. (TiO2磁珠富集磷酸化多肽)
5. 邹伦妃,张启伟,肖琛等.基于酰胺化的化学标记技术在磷酸化多肽分析中的应用[J].质谱学报,2022,43(04):463-472. （Si-TiO2用于磷酸化多肽富集）
6. 刘军. 基于内部萃取电喷雾电离质谱的典型含氟污染物诱导鱼类代谢紊乱研究[D].吉林大学,2022.DOI:10.27162/d.cnki.gjlin.2022.001228. （Si-TiO2用于代谢物富集）
7. Lihong Gao, et al. Nanocomplexes with anchored Rubpy32+-tetraethylene pentamine electrochemiluminescence system: Self-enhanced coupled photothermal strategy detection of thyroglobulin, Journal of Electroanalytical Chemistry, Volume 947, 2023, 117767, https://doi.org/10.1016/j.jelechem.2023.117767. (TiO2磁珠修饰)
8. Sen Zhang, et al. Magnetic Ti3C2 MXene Nanosheets Prepared for Enrichment of Phosphopeptides, ACS Appl. Mater. Interfaces 2023, 15, 13, 16505–16514, https://doi.org/10.1021/acsami.3c00848 (TiO2磁珠)
