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货号
产品名称
包装
PMG-TagAb003-1mL
PuriMag™ Anti-Flag Magnetic Beads （Anti-Flag磁珠）
1mL×1
PMG-TagAb003-5mL
1mL×5
保存条件： 4ºC保存，至少三个月有效。长期不使用，可以-20ºC保存，-20ºC可以保存更长时间。
一．产品简介
² PuriMag™ Anti-Flag Magnetic Beads，即Anti-Flag磁珠，也称Anti-Flag免疫磁珠或Flag抗体磁珠，是由高品质的Flag小鼠单克隆抗体与纳米级磁珠共价偶联而成，可特异性地与动植物或微生物裂解液、血清、腹水等中含有Flag标签的蛋白结合，从而用于带有Flag标签的融合蛋白或其蛋白复合物的免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）、免疫共沉淀（Co-IP）或纯化。
² Flag标签（Flag-tag）、Myc标签（Myc-tag）、HA标签（HA-tag）、His标签（His-tag）和GST标签（GST-tag）等是表达载体上最常见的一些标签，通过与这些标签的融合表达可以非常方便地检测目的蛋白及与目的蛋白相互结合的蛋白，也可以非常方便地用于目的蛋白的纯化。
² Flag-tag是8个氨基酸残基（DYKDDDDK）组成的多肽，常用的形式有Flag和3×Flag，通过基因重组技术把Flag-tag的核酸序列与目的基因的5’端或3’端连接，就可最终表达形成Flag-tag的目的蛋白。Flag-tag具有以下优点：Flag-tag通常不会与目的蛋白相互作用，并且大多数情况下不会影响目的蛋白的功能；Flag-tag作为标签蛋白，后续通过Flag抗体、Anti-Flag磁珠或Anti-Flag亲和凝胶即可对目的基因的表达、定位及功能进行检测或对目的蛋白进行纯化、免疫沉淀或免疫共沉淀等；融合在N端的Flag标签，可被肠激酶（Enterokinase, EK）切除（DDDK），从而得到完美的没有标签的目的蛋白。基于以上优点，Flag标签已被广泛应用于蛋白表达、纯化、鉴定、相互作用和功能等多方面的研究。
² PuriMag™ Anti-Flag Magnetic Beads，也被称为Anti-DYKDDDDK Magnetic Beads，可以特异性地结合Flag标签融合蛋白，并可以借助磁力架非常便捷地应用于带有Flag标签的融合蛋白或其蛋白复合物的免疫沉淀或纯化等实验。
² 本产品特异性强、靶蛋白结合量高。与国内外大多数的同类产品相比，本产品抗体结合密度高，对带有Flag标签蛋白的结合具有很强的特异性，并且本产品磁珠粒径小，不易产生非特异吸附。本产品悬液含约10mg磁珠/mL，含有不少于0.6mg Flag抗体，通常可结合不少于0.6mg Flag标签融合蛋白，具体的最大结合量和标签蛋白的分子量大小等相关。每500微升样品，通常仅需使用10-20 μL磁珠悬液，就可高效地进行免疫沉淀实验。
² 本产品可结合多种形式的Flag标签蛋白。本产品可特异性地结合甲硫氨酸修饰的N端Flag融合蛋白（Met-Flag-Protein）、N端Flag融合蛋白（Flag-Protein）、C端Flag融合蛋白（Protein-Flag）。
² 本产品结合目的蛋白速度快。本产品使用了~200nm纳米级磁珠，具有超大的比表面积，便于抗体和抗原的快速有效结合。通常10 min内即可完成抗原吸附的过程，30 min内完成目的蛋白免疫沉淀操作。缩短操作时间可以有效避免在长时间操作过程中目的蛋白的降解或变性，充分保证目的蛋白的活性。
² 本产品可选择多种洗脱方法。本产品可以根据目的蛋白的结构、生物学功能及后续应用的要求等，使用多种洗脱方法，包括Flag多肽、酸性和SDS-PAGE上样缓冲液等洗脱液进行洗脱。特别是Flag多肽洗脱后不会包含抗体的轻链和重链，可以有效解决免疫沉淀后Western实验中轻链和重链的干扰问题。本产品用于GFP-Flag融合蛋白的免疫沉淀效果参考图1。
二．主要技术指标
Product content
10mg/ml magnetic beads in specific protective buffer
Beads size
~200nm
Magnetization
Superparamagnetic
Coupled antibody
Anti-Flag mouse monoclonal antibody
Isotype
IgG2b
M.W. of antibody
Approximately 150kDa
Antibody concentration
≥ 0.6mg Flag antibody per ml beads
Binding capacity
≥ 0.6mg Flag‐tagged fusion protein per ml beads
Specificity
Met-Flag-Protein, Flag-Protein, Protein-Flag
Elution method
Acid, peptide competitive or SDS‐PAGE loading buffer elution. Note: If elute with SDS-PAGE loading buffer, the light (~25kDa) and heavy (~50kDa) chain of Flag antibody will be denatured and release from the beads.
Application
IP, Co-IP, Protein purification
三．注意事项
l 本产品经测试，反复冻融3次以上，不影响使用效果。
l 本产品需维持pH为6-8，避免高速离心和干燥；请勿长时间置磁珠于磁场中，否则可能会引起磁珠聚团。
l 本产品使用前要适当充分重悬，混匀操作须轻柔，不宜剧烈涡旋震荡等，避免抗体变性等。
l 在免疫沉淀或纯化时，建议设置阳性和阴性对照组。
l 蛋白样品收集后宜尽快完成纯化工作，并应始终放置在4ºC或冰浴，以减缓蛋白降解或变性。为有效抑制蛋白降解，可以在蛋白样品中添加适量的蛋白酶抑制剂混合物。
l 如果使用真空泵等仪器吸取上清液，须注意真空泵的吸液强度，以免吸力过大而吸取到聚集的磁珠。
l 酸性溶液洗脱时磁珠可能会发生聚集，属于正常现象，不影响磁珠的正常使用。0.1%的非离子型去垢剂（如Triton X-100、Tween-20或NP-40）可有效防止磁珠聚集，并且不会影响磁珠的抗体结合效率。
l 高浓度的DTT、巯基乙醇、盐酸胍等对本产品与标签蛋白的结合可能有一定影响，但Western及IP细胞裂解液、RIPA裂解液或NP-40裂解液等都完全适用。
l 本产品仅限于专业人员科研使用。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
四．使用说明
1. 样品的制备
a. 选择合适的裂解液，用于制备细胞或组织的裂解液。如果使用自行配制的或其它公司生产的裂解液，需要确保裂解液的pH为6-8。
b. 具体的细胞或组织样品裂解的制备步骤请参考裂解液的使用说明。制备好的裂解液上清宜置于冰上或4ºC存放，随后即可用于免疫沉淀或免疫共沉淀、标签蛋白的纯化等操作。新鲜制备好的样品，建议尽量当天完成免疫沉淀等后续操作，但如果样品不能当天使用，也可以适当分装后-80ºC冻存。
2. Anti-Flag磁珠的准备
由于Anti-Flag磁珠储存在特殊保护液中，所以需要在加入样品前适当洗涤。
a. 用移液器轻轻吹打重悬Anti-Flag磁珠，按照每500μl样品10μl或20μl磁珠悬浊液，取适量Anti-Flag磁珠至一洁净离心管中，加入1×TBS至最终体积为约0.5ml。
b. 用移液器轻轻吹打并充分重悬Anti-Flag磁珠。置于磁力架上分离10秒，去除上清。重复上述步骤两次。
c. 按照初始体积的量，用1×TBS重悬Anti-Flag磁珠。
3. 免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）
a. 加入磁珠与孵育。按照每500μl蛋白样品加入10μl或20μl磁珠悬浊液的比例加入Anti-Flag磁珠，置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育2小时或4ºC孵育过夜。注：孵育过程中，如果磁珠发生聚团或呈片状属正常现象，不会影响实验结果。
b. 磁分离。孵育完毕后，磁分离，去除上清。注：可保留部分上清液，用于检测免疫沉淀的效果。
c. 洗涤。加入500μl的1×TBS，用移液器轻轻吹打重悬Anti-Flag磁珠。磁分离，去除上清。重复洗涤三次。注：也可以通过检测洗涤得到的洗涤液的OD280来判断是否洗涤完全，若OD280大于0.05，应适当增加洗涤次数。
4. 洗脱
根据标签蛋白的特点及后续实验要求，可以选择如下3种方法之一进行洗脱。
a. 3×Flag竞争洗脱法：本方法为非变性法，洗脱效率高，且洗脱后的蛋白保持原有的生物活性，便于后续分析检测。
(a) 3×Flag多肽洗脱液的配制：取适量3×Flag多肽溶解于1×TBS中，使其终浓度为150μg/ml，或稀释5mg/ml的3×Flag多肽溶液至150μg/ml。
(b) 每10-20μl原始磁珠体积，加入100μl 3×Flag多肽洗脱液（150μg/ml），混匀后置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温摇晃孵育30-60分钟，或4ºC孵育1-2小时。为了提高洗脱效率，可延长孵育时间或重复洗脱。
(c) 孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，将上清转移到新的离心管中。上清即为洗脱的Flag标签蛋白。
(d) 洗脱的Flag标签蛋白置于4ºC待用，或者-20ºC或-80ºC长期保存。
b. 酸性洗脱法：本法为非变性法，比较快速且高效。洗脱后的蛋白保持原有的生物活性，便于后续分析检测。
(a) 溶液的配制：酸性洗脱液（0.1M Glycine-HCl, pH3.0），中和液（0.5M Tris-HCl, pH7.4, 1.5M NaCl）。
(b) 每10-20μl原始磁珠体积，加入100μl酸性洗脱液，混匀后置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育5分钟。注：孵育时间不宜超过15分钟。
(c) 孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，将上清转移到新的离心管中，并立刻加入10μl中和液，适当混匀。
(d) 为了获得最大的洗脱效率，可重复步骤b和c，并将相同样品合并。
(e) 洗脱并中和的Flag标签蛋白置于4ºC待用，或者-20ºC或-80ºC长期保存。
注1：酸性洗脱法虽然高效，但仍可能低于竞争洗脱法或SDS-PAGE上样缓冲液洗脱法。
注2：由于目的蛋白的差异可能对酸性洗脱法的洗脱效率有一定的影响，如果对洗脱效率的要求比较高，可对酸性洗脱液的pH在2.5-3.1之间进行一定的调整，相应的中和液的pH值或量也要进行一定的调整，例如100μl酸性洗脱液（0.1M Glycine-HCl, pH2.8）和15μl中和液（1M Tris-HCl, pH8.5）。
c. SDS-PAGE上样缓冲液洗脱法：本方法为变性法，得到的蛋白样品适合SDS-PAGE电泳或WB检测。
(a) SDS-PAGE上样缓冲液的配制：参考《分子克隆》等配制5×或2×的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，然后加入水配制成1×的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。通常SDS-PAGE蛋白上样缓冲液含有DTT等还原剂，其洗脱得到的蛋白样品中会含有Flag抗体的轻链和重链。
(b) 每10-20μl原始磁珠体积的磁珠，加入100μl 1× SDS-PAGE上样缓冲液，95ºC加热5分钟。
(c) 置于磁力架上分离10秒，取上清进行SDS-PAGE电泳或Western检测。
