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1. 概述
PuriMagTM G-IA碘乙酰基活化磁性纳米微粒是均一的、聚合物包覆的超顺磁纳米粒，亲水表面确保磁珠在各种缓冲液中具有出色的分散性、低非特异吸附和易操作性，表面涂有高密度的碘乙酰基官能团。磁珠粒用于共价偶联含巯基（-SH）的配体。
PuriMagTM G-IA碘乙酰基活化磁性纳米微粒最适合结合较大的蛋白和小肽，因为亲水性接头可以减少空间位阻。随后，可以高度严格地洗涤含有共价连接的蛋白质的磁珠，实际上消除了任何非特异性结合的蛋白质。独特的表面意味着在基于蛋白质的系统中低的非特异性结合，并且无需使用表面活性剂即可实现出色的处理效果。这些高结合力的磁珠适合在各种研究和诊断应用中使用，无论您是在实验室规模还是对高通量应用有更严格的要求。
特点和优点：
1）与半胱氨酸残基共价和特异结合；
2）水不溶性配体可以在终浓度为10-30％的乙腈或二甲基甲酰胺（DMF）或二甲基亚砜（DMSO）的偶联缓冲液中或在终浓度为6 M盐酸胍的偶联缓冲液中偶联；
3）稳定的共价键和低水平的配体泄漏；
4）产生可重复使用的免疫亲和基质；
5）低非特异性结合；
6）固定1~20 mg蛋白质或0.1~2mg肽/ g磁珠
7.）应用：抗体，蛋白质/肽，DNA / RNA的纯化；细胞分选，免疫沉淀
PuriMagTM碘乙酰磁珠偶联巯基原理：
2. 产品信息
Product Specifications
Description
Polymer coated Fe3O4 nanoparticles
Particle Size
200 nm
Number of Beads
~1.7×1010 beads/mg
Matrix
Proprietary polymer
Functional group
Iodoacetyl groups
Group density
~300 µmole / g of Beads
Magnetization
60~70 EMU/g
Formulation
10mg/mL in in 1M NaCl and 0.02% NaN3
Stability
pH 3.5~10, 4~50 ℃, most organic solvents
Storage
1 year at 2~8 ℃. Do not freeze.
3. 使用方法
注意：以下方案是将蛋白或多肽与PuriMagTM G-IA碘乙酰基封端的磁珠偶联的示例。强烈建议进行滴定，以优化用于每种单独应用的磁珠量。该协议可相应地按比例放大和缩小。
A. 所需材料
1）磁力架（用于手动操作）：用于容纳12个单独的1.5~2ml离心管（Mrack02）；用于容纳2个50 ml离心管或2个15 ml离心管（目录号Mrack03）
2）偶联缓冲液
可溶性配体偶联缓冲液：50 mM Tris, 5 mM EDTA-Na, pH 8.5；
不溶性配体偶联缓冲液：50 mM Tris, 5 mM EDTA-Na, pH 8.5, 20- 30% DMSO or DMF or 6M guanidine•HCl
3）洗涤液： 1 M sodium chloride (NaCl) in distilled H2O
4）封闭化合物L-Cysteine•HCl
5）TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine)
6）Phosphate buffered saline (PBS)
B. 样品准备
注意：
确保要结合的蛋白质/肽具有游离的（还原的）巯基。为了确保可用的巯基游离基，必须使用DTT (dithiothreitol), TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine), or 2-MEA (2-Mercaptoethylamine•HCl) 等还原剂还原二硫键，然后进行脱盐或透析去除还原剂。
如果重新合成后立即使用新合成的肽，则可直接用于偶联。
对于蛋白质，在室温下用5-10 mM TCEP溶液处理蛋白质30分钟，然后进行透析或脱盐柱。对于IgG抗体，建议使用2-MEA，因为其选择性减少了铰链区二硫键。
如果样品中含有带有游离巯基的还原剂（例如2-巯基乙醇、DTT或TCEP），则必须通过透析或脱盐将其彻底去除。
1）如果可溶，将1-10mg蛋白质/肽溶解在1ml可溶性偶联缓冲液中。如果不溶，则溶于1ml不溶性偶联缓冲液中。
2）如果样品已经悬浮在其他缓冲液中，请用等体积的耦合缓冲液稀释样品。
C. PuriMagTM磁珠的准备
1）称重并将3 mg磁珠转移到离心管中。通过添加100 μl偶联缓冲液重悬磁珠，并通过剧烈涡旋1~2分钟混合磁珠。
注意：重新水合后，由于官能团的稳定性，应尽快使用磁珠；将一些磁珠悬浮在缓冲液中后，可能会聚集，可以通过剧烈涡旋或非常温和的超声处理10~30秒将其完全悬浮。
2）磁分离，除去上清液。从磁力架移出离心管，并用1 ml偶联缓冲液涡旋悬浮磁珠30秒钟。
3）重复步骤2一次。
D. 偶联
1）将B1或B2中的样品添加到洗涤过的PuriMagTM磁珠中，并在室温下轻轻旋转孵育30-60分钟。
2）如C2所述，用1ml偶联缓冲液洗涤磁珠四次。
3）通过将磁珠悬浮在1ml偶联缓冲液中（含8mg的Cysteine•HCl的），并在室温下温育30-60分钟，以封闭磁珠上多余的活性基团。
4）如C3所述，用1ml洗涤缓冲液洗涤PuriMagTM磁珠四次。
5）将磁珠重悬于含有0.05％叠氮化钠的PBS缓冲液中，并储存在4℃下。
E. 一般亲和纯化方案
注意：设计通用的纯化DNA或RNA的方案相对简单，因为核酸的生化特性相对一致。但是，设计一种通用的亲和纯化方案非常困难，因为每种蛋白质都有不同的组成和结构。为了获得最佳结果，每个用户都必须为各个应用程序确定最佳工作条件。
1）将最适量的PuriMagTM磁珠转移到离心管中。磁分离1~3分钟，除去上清液。
注意：强烈建议根据粗样品中目标蛋白的量进行滴定，以优化用于每种应用的磁珠的量。所用磁珠过多会导致较高背景，而所用磁珠太少则会导致较低产量。每mg的磁珠通常结合1~20 ug的目标蛋白。
2）取下离心管，用5倍磁珠体积的PBS缓冲液悬浮30秒。磁分离1~3分钟，除去上清。
3）重复步骤2两次
4）将洗涤过的PuriMagTM磁珠加入含有目标蛋白的粗样品中，并在室温或所需温度下孵育1~2小时（较低的温度需要更长的孵育时间）。
5）用5倍磁珠体积的PBS缓冲液或1M NaCl充分洗涤磁珠，直到280 nm洗脱液的吸光度接近背景水平（OD 280 <0.05）。
6）通过适当的方法洗脱目标蛋白，例如低pH（2~4）、高pH（10~12）、高盐、高温、亲和洗脱或在SDS-PAGE上样缓冲液中煮沸。
