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一、概述
Magarose-ProA（ProG、ProA/G、ProL）抗体纯化磁珠系列产品是由NHS活化的磁性琼脂糖微球与Protein A（or Protein G）共价结合形成的复合微粒。与当前国际免疫磁珠市场上同类产品相比，该产品具有更高的抗体结合能力和较低的蛋白非特异吸附率，洗脱条件更均一，一步纯化即可从血清样品中分离出纯度大于90%的抗体。本产品为微米级磁性微球，熟练操作可在15 min内完成抗体吸附过程，30 min内完成抗体纯化流程。本产品可重复使用，适用于血浆、腹水、组织培养上清液等样品中的抗体纯化，也可用于抗体固定及其它相关研究。用户可根据目标抗体的种属来源及亚型选择磁珠的类别，Magarose-ProA（roG、ProA/G、ProL）磁珠与不同抗体的亲和性比较参见http://www.purimagbead.com/html/4309815423.html。
二、产品特性
产品名称
Magarose-ProA （ProG、ProA/G、ProL）
货号
PMAG008
磁珠浓度
25% (v/v) in PBST（含0.05% NaN3）
配基密度
/
介质
6%交联磁性琼脂糖
粒径
20-45μm
配体结合
~40 mg Human IgG /ml磁珠
保存
2~8℃保存一年
注：磁珠蛋白结合量与目标蛋白特性相关，此处仅作参考值。
三、缓冲液
Binding/Washing buffer PBST（pH 7.2~7.4）: 137 mM NaCl，2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2.0 mM KH2PO4, 0.1% Tween-20;
NP40 Cell Lysis Buffer: 150mM NaCl, 1% NP40, 50mM Tris, pH 7.4
Elution buffer: 100mM Glycine, 0.1% Tween-20, pH 2.5;
Neutrilization buffer: 1.0 M Tris-HCl, pH 9.0;
四. 操作流程
1) 样品处理
血清样品处理：若目标蛋白丰度较高，建议用 Binding Buffer 稀释样品至目标蛋白终浓度为10~100 µg/mL，置于冰上备用（或-20℃长期保存）。
悬浮细胞样品处理：离心收集细胞（4℃, 500 g, 10 min），弃上清后称重，按1.0×105个细胞20~30 µL的比例加PBS洗2次；按1.0×105个细胞20~30 µL的比例加NP40 Cell Lysis Buffer，同时加蛋白酶抑制剂（如终浓度1 mM的PMSF），混匀后于冰上处理 10min；离心收集上清（4℃，14000 g,10 min），置于冰上备用（或-20℃长期保存）。
贴壁细胞样品处理：移去培养基，用PBS洗涤两次；用胰酶消化或者细胞刮刀，收集1.5 mL离心管内，按1.0×105个细胞20~30 µL的比例加PBS洗涤2次；按1.0×105个细胞20~30 µL的比例加NP40 Cell Lysis Buffer，同时加蛋白酶抑制剂（如终浓度为1 mM的PMSF），混匀后于冰上处理10min；离心收集上清（4℃, 14000 g, 10 min），置于冰上备用（或-20℃长期保存）。
大肠杆菌样品处理：离心收集大肠杆菌（4℃, 12000 g, 2 min），弃上清后称重，按每克（湿重）菌体10 mL的比例用PBS洗涤2次；按每克（湿重）菌体5~10 mL 的比例加入Binding Buffer，同时加入蛋白酶抑制剂（如终浓度为1 mM的PMSF），重悬菌体，超声裂解细胞，离心收集上清（4℃, 17000 g, 10 min）。
2) 磁珠预处理：将抗体纯化磁珠漩涡振荡30 s，充分重悬磁珠；取40 μL 25 %（v/v）磁珠悬液置于1.5 mL EP管中。磁分离，弃上清，用1 mL Binding/Washing buffer洗2次，磁分离，管中磁珠可直接用于抗体分离。注：该步磁珠用量可根据磁珠对目标抗体最大结合量进行调节。
3) 抗体吸附：
A. 用 100µLPBST 稀释 2~20µg 抗体样品，稀释后加入磁珠离心管； 注：实际抗体使用量需根据实验摸索，可参看磁珠对应不同抗体亚型的亲和力表；
B. 将上述混合物室温混匀10~15分钟；
C. 磁分离，去上清；100µLPBST 洗磁珠3 次。
4）抗原沉淀反应
A. 抗原吸附：向上步装有磁珠-抗体复合物的离心管加裂解液100~1000µL，移液枪吹打混匀；
B. 37℃颠倒混匀或者低速涡旋混匀 15~20 分钟，使抗原和结合抗体的磁珠结合；
注：为使结合充分，孵育时间温度可据实际需求调整；
C. 将上一步的离心管和混合物放入磁力架，吸取上清（上清可丢弃也可保存做后续分析）；
D. 取200µL PBS洗磁珠-抗体-抗原复合物3次；
E. 洗涤后用100µL PBS重悬磁珠，用于下一步。
注：抗原洗脱前将磁珠转移新的离心管，避免将管壁上原有的非特异性吸附蛋白一起洗脱。
5）抗原洗脱
操作者根据后期检测选择抗原洗脱方法。
变性洗脱法： 将装有磁珠-抗体-抗原复合物的离心管，磁分离去上清；向离心管中加入25µLElution Buffer和5µL 5x SDS-PAGE Loading Buffer（自备）重悬复合物； 95~100℃煮沸5~10分钟；将煮沸后的离心管放入磁力架取上清做后续分析（注：上清液中含有抗原勿丢弃）。
非变性洗脱法： 将沉淀抗原第5步骤中的磁珠放入磁力架，磁分离去上清；向离心管中加入约30µL的Elution Buffer，用移液器轻轻混匀避免气泡，颠倒混匀2~5分钟；磁分离收集上清（注：上清液中含有抗原勿丢弃）；
中和：上述收集上清中抗原，若需做功能验证需加入Neutralization Buffer（例：100µLElution Buffer加入10 µL Neutralization Buffer即可）。
6）Target Antigen Detection（沉淀后抗原分析）
A. 变性洗脱抗原适用方向
1. 蛋白染色鉴定； 2. Western blotting；3. SDS-PAGE for Fluorography
B. 非变性洗脱抗原适用方向
1. 蛋白特征分析；2. 免疫；3. 酶学研究；4. 氨基酸序列分析；5. 蛋白晶体结构分析
C. 未做洗脱抗原适用方向
1. 蛋白相互作用；2. 酶学研究；3. 生物分析；4. 免疫学分析
五. 磁珠再生
1. 磁珠多次使用后会有沉淀蛋白、强疏水蛋白、脂蛋白等杂质非特异性吸附，为了保证磁珠使用效率，建议持续使用 5 次后进行磁珠再生。
2. 按约每 1 mL 10%（v/v） 磁珠加入 1 mL 1%（v/v）Triron X-100 磁珠再生缓冲液，振荡均匀，在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转混合，10 min 后进行磁性分离，弃上清液。
3. 立即加入 1 mL Binding/Washing buffer 进行重悬，然后磁分离，弃上清，重复该操作 3 次。
4. 加1 mL Storage buffer重悬磁珠，2~8℃保存。
六. 注意事项
1. 磁珠应保存在储存溶液中，防止干燥；
2. 请勿将磁珠冷冻或离心，以免不可逆聚集；
3. 为保证最佳的实验结果，请选择特异性较强的抗体进行免疫沉淀反应；
4. 操作者根据实际需求，利用抗体及抗原结合反应步骤中收集的上清液，检测抗体、抗原和磁珠的结合情况；
5. 对于 IP 实验，不同类型的抗体抗原结合的亲和性是有区别的，抗体与抗原结合还会受结合缓冲液和洗涤缓冲液的影响，因此，如操作者使用本方案的缓冲体系不能获得很好的实验结果，可自行筛选及配制缓冲液进行实验；
6. 磁珠表面包被Protein A/G 在极端条件（如低 pH、加热处理）存在极低蛋白脱落情况；
7. 不建议用于分子量约 130 kD 目标蛋白的免疫沉淀实验。
3. 磁珠再生
1) 磁珠多次使用后会有沉淀蛋白、强疏水性蛋白、脂蛋白等杂质非特异性吸附到磁珠上，为了保证磁珠的使用效率，建议持续使用5次后进行磁珠再生处理。
2) 按每1 mL 25%（v/v） 磁珠加入2 mL 1%（v/v）Triron X-100磁珠再生缓冲液，振荡均匀，在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转混合，10 min后进行磁性分离，弃上清液。
3) 立即加入1 mL Binding/Washing buffer进行重悬，然后磁性分离，弃上清液，重复该操作3次。
4) 加入1 mL Storage buffer重悬磁珠，2~8℃保存。
