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1. 概述
点击化学描述了在温和水溶液中快速选择性地“点击”反应成对官能团。 Click Chemistry 的概念已转变为方便、通用且可靠的分子 A 和 B 的两步偶联程序，广泛用于生物科学、药物发现和材料科学。
叠氮化物磁性纳米微粒（PuriMagTM G-N3磁珠）是均一的、聚合物包覆的超顺磁纳米粒，亲水表面确保磁珠在各种缓冲液中具有出色的分散性、低非特异吸附和易操作性，表面涂有高密度叠氮活性基团。PuriMagTM G-N3磁珠是一种有效的磁性纳米粒子，可通过Cu（I）催化的叠氮化物-炔烃环加成（CuAAC）或无Cu（I）的叠氮化物-DBCO通过CLICK反应i共价捕获功能化的蛋白质。目标蛋白质需要在代谢、酶促或化学上带有炔烃标记（Cu（I）催化反应）或DBCO标记（不含Cu（I）的反应）。随后，可以高度严格地洗涤含有共价连接的蛋白质的叠氮化物磁珠，实际上消除了任何非特异性结合的蛋白质。独特的表面意味着在基于蛋白质的系统中低的非特异性结合，并且无需使用表面活性剂即可实现出色的处理效果。这些高结合力的磁珠适合在各种研究和诊断应用中使用，无论您是在实验室规模还是对高通量应用有更严格的要求。叠氮化物磁珠在有机溶剂和高尿素浓度中不稳定。
特点与优势：
w 高结合能力；
w 快速、高效的偶联；
w 亲水性长臂间隔子，可将空间位阻和非特异性结合降至最低；
w 偶联后表面没有电荷；
w 稳定的共价键，配体泄漏最少；
w 低非特异性结合；
w 1~20 mg蛋白质或0.1~2mg肽/ g磁珠；
磁珠偶联原理示意图：
2. 产品信息
Product Specifications
Description
Polymer coated Fe3O4 nanoparticles
Particle Size
200 nm
Number of Beads
~1.7×1010 beads/mg
Matrix
Proprietary polymer
Functional group
Azide group
Group density
~300 µmole / g of Beads
Magnetization
60~70 EMU/g
Formulation
10mg/mL in DI water
Storage
1 year at 2~8 ℃. Do not freeze.
3. 使用方法
A. 所需材料
・t-butyl alcohol (t-BuOH) 12mL
・Dimethylsulfoxide (DMSO) 3mL
・Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine（TBTA） M.W. 530.63 2.7mg
・Copper(Ⅱ)sulfate（CuSO4） M.W. 159.61 16mg
・(＋)-Sodium L-ascorbate M.W. 198.11 20mg
・Methanol （MeOH） 4mL
B. 偶联方法
为了进行筛选，首先需要优化配体在PuriMagTM磁珠上的固定量。您可以通过更改配体的浓度来更改配体的固定量。该实验方案显示了一种将配体固定在叠氮化物磁珠上时以0μM，5μM，25μM和125μM四种不同浓度固定配体的方法。
B-1. 解决方案的准备
1）通过将12mL的t-BuOH与3mL的DMSO混合来制备15mL的t-BuOH / DMSO溶液（t-BuOH：DMSO = 4：1）
2）将配体（化合物）溶解在t-BuOH / DMSO溶液中，并制备200μL的500μM配体溶液。
3）将2.7mg TBTA溶于1mL的t-BuOH / DMSO溶液中，并准备1mL的5mM TBTA溶液。将190μL的t-BuOH / DMSO溶液添加到10μL的5mM TBTA中，并准备200μL的250μMTBTA溶液。
4）将16mg的CuSO4溶于1mL的超纯水中，并准备1mL的100mM CuSO4溶液。将190μL超纯水添加到10μL的100mM CuSO4溶液中，并准备200μL的5mM CuSO4溶液。
5）将20mg（+）-L-抗坏血酸钠溶解在1mL超纯水中，并准备1mL 100mM（+）-L-抗坏血酸钠溶液。向100μM（+）-L-抗坏血酸钠溶液10μL中加入190μL超纯水，并准备200μL的5mM（+）-L-抗坏血酸钠溶液。
6）将4mL以上1）中制备的t-BuOH / DMSO溶液与4mL超纯水混合，制备8mL的t-BuOH / DMSO /超纯水。 （t-BuOH / DMSO溶液：超纯水= 1：1）。
B-2. 固定配体
1）将2.5 mg叠氮化物磁珠添加到四个微管中的每一个中。在室温下磁分离，并丢弃上清液。
2）加入500μl的t-BuOH / DMSO溶液，然后分散磁珠。在室温下磁分离，并丢弃上清液。
3）再重复上述2）两次，然后进行溶剂置换。
4）从顶部溶液叠氮化物磁珠到底部抗坏血酸钠，按如下表所示顺序添加每种反应溶液。在这种情况下，添加250μM的TBTA后，用超声波装置分散PuriMagTM磁珠。然后，添加剩余的解决方案（如下表）。
Concentration (um)
0
5
25
125
Azide beads (mg)
2.5
t-BuOH/DMSO (ul)
250
240
200
500uM ligands (ul)
250uM TBTA (ul)
Ultrapure water (ul)
5mM CuSO4 (ul)
5mM (＋)-Sodium L-ascorbate (ul)
Total (ul)
500
5）通过使用微型管混合器在室温下反应16至20小时。
6）在室温下磁分离，并丢弃上清液。
7）加入500μl的t-BuOH / DMSO /超纯水溶液，并用超声装置分散PuriMagTM磁珠。
8）在室温下磁分离，并丢弃上清液。
9）再重复上述7）至8）两次。 （用t-BuOH / DMSO /超纯水溶液洗涤磁珠，共三遍。）
10）加入500μL50％MeOH，并用超声装置分散磁珠。
11）在室温下磁分离，并丢弃上清液。
12）再重复上述10）至11）两次。 （将磁珠总共洗三遍。）
13）将磁珠分散在100μL的50％MeOH中，并保存在4℃下。
（配体固定磁珠的浓度：0.5 mg / 20μL）
客户发表相关论文：
1. Mao-Hua Gao, et al. Identification and Quantification of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine on Random DNA Sequences by a Nanoconfined Electrochemiluminescence Platform, Analytical Chemistry, 2023, 95, 25, 9598-9604, https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c01252 (Azide磁珠偶联DBCO-核酸探针)
