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货号
产品名称
包装
PMG-TagAb009-0.5mL
PuriMag™ Anti-GFP Magnetic Beads （Anti-GFP磁珠）
0.5mL×1
PMG-TagAb009-2mL
0.5mL×4
保存条件： 4ºC保存，至少三个月有效。长期不使用，可以-20ºC保存，-20ºC可以保存更长时间。
一．产品简介
² PuriMag™ Anti-GFP Magnetic Beads，即Anti-GFP磁珠，也称Anti-GFP免疫磁珠或GFP抗体磁珠，是由高品质的GFP小鼠单克隆抗体与纳米级磁珠共价偶联而成，可特异性地与动植物或微生物裂解液、血清、腹水等中含有GFP标签的蛋白结合，从而用于带有GFP标签的融合蛋白或其蛋白复合物的免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）、免疫共沉淀（Co-IP）或纯化。
² Flag标签（Flag-tag）、Myc标签（Myc-tag）、HA标签（HA-tag）、His标签（His-tag）和GFP标签（GFP-tag）等是表达载体上最常见的一些标签，通过与这些标签的融合表达可以非常方便地检测目的蛋白及与目的蛋白相互结合的蛋白，也可以非常方便地用于目的蛋白的纯化。
² GFP （green fluorescent protein, 绿色荧光蛋白）最早是由下村修、钱永健等人于1962年在维多利亚多管发光水母（Aequorea victoria）中发现的，当受到紫外或蓝光激发时，发射绿色荧光。GFP或其突变体EGFP（enhanced green fluorescent protein, 增强型绿色荧光蛋白）与目的蛋白融合表达被广泛用于基团表达调控、转基因功能、目的蛋白在细胞中的表达、分布和迁移、以及高通量药物筛选等方面的研究。GFP标签的优点是便于观察，适合于观察蛋白在细胞内的定位，不用破碎组织细胞、不加任何底物、不用抗体，直接通过荧光显微镜就能在活细胞中观察到发出的绿色荧光，实时观察目的蛋白的表达情况，而且荧光性质稳定，细胞内的其它产物不会干扰GFP标签蛋白的检测，从而使其检测快速、简便、灵敏度高、重现性强，所以GFP被誉为活细胞探针。但GFP标签的分子量较大，约为25kDa，与目的基因形成融合蛋白时可能会影响目的蛋白的功能。
² PuriMag™ Anti-GFP Magnetic Beads，也可以特异性地结合GFP或EGFP标签融合蛋白，并可借助磁力架非常便捷地用于带有GFP标签的融合蛋白或其蛋白复合物的免疫沉淀或纯化等实验。
² 本产品特异性强、靶蛋白结合量高。与国内外大多数的同类产品相比，本产品抗体结合密度高，对带有GFP标签蛋白的结合具有很强的特异性，并且本产品磁珠粒径小，不易产生非特异吸附。本产品悬液含约10mg磁珠/mL，含有不少于0.6mg GFP抗体，通常可结合不少于0.6mg GFP标签融合蛋白，具体的最大结合量和标签蛋白的分子量大小等相关。每500微升样品，通常仅需使用10-20 μL磁珠悬液，就可高效地进行免疫沉淀实验。
² 本产品可结合多种形式的GFP标签蛋白。本产品可特异性地结合N端GFP融合蛋白（GFP-Protein）、C端GFP融合蛋白（Protein-GFP）。
² 本产品结合目的蛋白速度快。本产品使用了~200nm纳米级磁珠，具有超大的比表面积，便于抗体和抗原的快速有效结合。通常10 min内即可完成抗原吸附的过程，30 min内完成目的蛋白免疫沉淀操作。缩短操作时间可以有效避免在长时间操作过程中目的蛋白的降解或变性，充分保证目的蛋白的活性。
² 本产品可选择多种洗脱方法。本产品可以根据目的蛋白的结构、生物学功能及后续应用的要求等，使用多种洗脱方法，包括GFP多肽、酸性和SDS-PAGE上样缓冲液等洗脱液进行洗脱。特别是GFP多肽洗脱后不会包含抗体的轻链和重链，可以有效解决免疫沉淀后Western实验中轻链和重链的干扰问题。本产品用于GFP-GFP融合蛋白的免疫沉淀效果参考图1。
二．主要技术指标
Product content
10mg/ml magnetic beads in specific protective buffer
Beads size
~200nm
Magnetization
Superparamagnetic
Coupled antibody
Anti-GFP mouse monoclonal antibody
Isotype
IgG1
M.W. of antibody
Approximately 150kDa
Antibody concentration
≥ 0.6mg GFP antibody per ml beads
Binding capacity
≥ 0.6mg GFP‐tagged fusion protein per ml beads
Specificity
GFP-Protein, Protein-GFP
Elution method
Acid, peptide competitive or SDS‐PAGE loading buffer elution. Note: If elute with SDS-PAGE loading buffer, the light (~25kDa) and heavy (~50kDa) chain of GFP antibody will be denatured and release from the beads.
Application
IP, Co-IP, Protein purification
三．注意事项
l 本产品经测试，反复冻融3次以上，不影响使用效果。
l 本产品需维持pH为6-8，避免高速离心和干燥；请勿长时间置磁珠于磁场中，否则可能会引起磁珠聚团。
l 本产品使用前要适当充分重悬，混匀操作须轻柔，不宜剧烈涡旋震荡等，避免抗体变性等。
l 在免疫沉淀或纯化时，建议设置阳性和阴性对照组。
l 蛋白样品收集后宜尽快完成纯化工作，并应始终放置在4ºC或冰浴，以减缓蛋白降解或变性。为有效抑制蛋白降解，可以在蛋白样品中添加适量的蛋白酶抑制剂混合物。
l 如果使用真空泵等仪器吸取上清液，须注意真空泵的吸液强度，以免吸力过大而吸取到聚集的磁珠。
l 酸性溶液洗脱时磁珠可能会发生聚集，属于正常现象，不影响磁珠的正常使用。0.1%的非离子型去垢剂（如Triton X-100、Tween-20或NP-40）可有效防止磁珠聚集，并且不会影响磁珠的抗体结合效率。
l 高浓度的DTT、巯基乙醇、盐酸胍等对本产品与标签蛋白的结合可能有一定影响，但Western及IP细胞裂解液、RIPA裂解液或NP-40裂解液等都完全适用。
l 本产品仅限于专业人员科研使用。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
四．使用说明
1. 样品的制备
a. 选择合适的裂解液，用于制备细胞或组织的裂解液。如果使用自行配制的或其它公司生产的裂解液，需要确保裂解液的pH为6-8。
b. 具体的细胞或组织样品裂解的制备步骤请参考裂解液的使用说明。制备好的裂解液上清宜置于冰上或4ºC存放，随后即可用于免疫沉淀或免疫共沉淀、标签蛋白的纯化等操作。新鲜制备好的样品，建议尽量当天完成免疫沉淀等后续操作，但如果样品不能当天使用，也可以适当分装后-80ºC冻存。
2. Anti-GFP磁珠的准备
由于Anti-GFP磁珠储存在特殊保护液中，所以需要在加入样品前适当洗涤。
a. 用移液器轻轻吹打重悬Anti-GFP磁珠，按照每500μl样品10μl或20μl磁珠悬浊液，取适量Anti-GFP磁珠至一洁净离心管中，加入1×TBS至最终体积为约0.5ml。
b. 用移液器轻轻吹打并充分重悬Anti-GFP磁珠。置于磁力架上分离10秒，去除上清。重复上述步骤两次。
c. 按照初始体积的量，用1×TBS重悬Anti-GFP磁珠。
3. 免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）
a. 加入磁珠与孵育。按照每500μl蛋白样品加入10μl或20μl磁珠悬浊液的比例加入Anti-GFP磁珠，置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育2小时或4ºC孵育过夜。注：孵育过程中，如果磁珠发生聚团或呈片状属正常现象，不会影响实验结果。
b. 磁分离。孵育完毕后，磁分离，去除上清。注：可保留部分上清液，用于检测免疫沉淀的效果。
c. 洗涤。加入500μl的1×TBS，用移液器轻轻吹打重悬Anti-GFP磁珠。磁分离，去除上清。重复洗涤三次。注：也可以通过检测洗涤得到的洗涤液的OD280来判断是否洗涤完全，若OD280大于0.05，应适当增加洗涤次数。
4. 洗脱
根据标签蛋白的特点及后续实验要求，可以选择如下2种方法之一进行洗脱。
a. 酸性洗脱：本法为非变性法，比较快速且高效。洗脱后的蛋白保持原有的生物活性，便于后续分析检测。
(a) 溶液的配制：酸性洗脱液（0.1M Glycine-HCl, pH3.0），中和液（0.5M Tris-HCl, pH7.4, 1.5M NaCl）。
(b) 每10-20μl原始磁珠体积，加入100μl酸性洗脱液，混匀后置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育5分钟。注：孵育时间不宜超过15分钟。
(c) 孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，将上清转移到新的离心管中，并立刻加入10μl中和液，适当混匀。
(d) 为了获得最大的洗脱效率，可重复步骤b和c，并将相同样品合并。
(e) 洗脱并中和的GFP标签蛋白置于4ºC待用，或者-20ºC或-80ºC长期保存。
注1：酸性洗脱法虽然高效，但仍可能低于竞争洗脱法或SDS-PAGE上样缓冲液洗脱法。
注2：由于目的蛋白的差异可能对酸性洗脱法的洗脱效率有一定的影响，如果对洗脱效率的要求比较高，可对酸性洗脱液的pH在2.5-3.1之间进行一定的调整，相应的中和液的pH值或量也要进行一定的调整，例如100μl酸性洗脱液（0.1M Glycine-HCl, pH2.8）和15μl中和液（1M Tris-HCl, pH8.5）。
b. SDS-PAGE上样缓冲液洗脱：本方法为变性法，得到的蛋白样品适合SDS-PAGE电泳或WB检测。
(a) SDS-PAGE上样缓冲液的配制：参考《分子克隆》等配制5×或2×的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，然后加入水配制成1×的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。通常SDS-PAGE蛋白上样缓冲液含有DTT等还原剂，其洗脱得到的蛋白样品中会含有GFP抗体的轻链和重链。
(b) 每10-20μl原始磁珠体积的磁珠，加入100μl 1× SDS-PAGE上样缓冲液，95ºC加热5分钟。
(c) 置于磁力架上分离10秒，取上清进行SDS-PAGE电泳或Western检测。
