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一、概述
氨基活化琼脂糖磁珠（Magarose-NH2）是一种6%交联的磁性琼脂糖微球，磁珠在长间隔臂的末端含有反应性伯胺，含有羧基（-COOH）的分子共价偶联，用于亲和纯化。凝胶对于固定肽而言是理想的，用于抗体或其他结合配偶体的亲和纯化。
尽管其他胺反应性方法可将分子固定化在氨基活化琼脂糖磁珠上，但碳二亚胺（EDC）在交联剂中是独特的，使得能够通过-COOH偶联。在近中性至酸性pH缓冲液中，EDC能有效地与羧酸盐反应形成中间体酯，其与亲核试剂如氨基活化琼脂糖磁珠上的伯胺反应。在大多数亲和纯化方法中，分子和琼脂糖凝胶载体之间产生的酰胺键是稳定的，并且可防渗漏。
氨基活化琼脂糖磁珠也适用于通过5'-磷酸基团固定寡核苷酸。在咪唑存在下，EDC以与羧酸盐大致相同的方式有效地与磷酸基团反应。
二、产品特性
产品名称
Magarose-NH2
货号
PMAG018，PMAG019
磁珠浓度
25% (v/v) in 0.02% sodium azide
配基密度
~ 60 μmol NH2/ ml磁珠
介质
6%交联磁性琼脂糖
粒径
20-45μm
配体结合
>20 mg IgG/ml磁珠
保存
常温运输，2~8℃保存一年
注：磁珠蛋白结合量与目标蛋白特性相关，此处仅作参考值。
三、使用方法
1. 重要产品信息
• 使用EDC时，氨基磁珠将与C-末端、天冬氨酸或谷氨酸残基的侧链-COOH相偶联。因为肽还含有伯胺（N-末端和赖氨酸残基的侧链），使用EDC的偶联将导致肽的聚合以及它们固定到凝胶支持物上。通常这种聚合对随后的亲和纯化方法无害。
• 连接水不溶性肽或其他分子时，请使用与水混溶的溶剂，如乙醇、甲醇、DMSO或DMF。首先将肽溶解在水混溶性溶剂中，然后将该溶液加入偶联缓冲液中。偶联反应中高达50％的有机溶剂浓度是相容的，除非已知肽在该浓度下变性。
• 传统上，MES缓冲液用于EDC反应，因为它不含有竞争性的胺或磷酸盐，并且有效地保持了最佳的偶联酸条件。然而，如果需要，可以替换其他缓冲液，并且偶联将有效地进行至pH 7.2。尽管磷酸盐缓冲液可以与EDC反应，但降低偶联效率。乙酸盐、Tris和甘氨酸缓冲液与EDC或O-酰基异脲中间体反应，不是合适的偶联缓冲液。另外，避免使用含有硫醇的缓冲液，这些硫醇不可逆地结合EDC并使之失活。碘化物、氯化物和溴化物等卤化物对pH值为5和7之间的EDC几乎没有影响。
• EDC / Magarose-NH2方法也可用于通过5'-磷酸基团固定寡核苷酸。
2. 使用EDC和Magarose-NH2的肽固定化方法
注意：此方法使用2mL 磁珠Magarose-NH2（8mL浆液）偶联1-10mg肽。对于其他体积、肽量请相应调整程序。
A. 所需材料
· 偶联缓冲液：0.1M MES缓冲液[2-（N-吗啉代）乙磺酸]，0.9％NaCl，pH4.7
• 洗涤液：1M NaCl
• EDC [1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺HCl]
B. 试剂制备
将1-10mg肽溶解在2mL偶联缓冲液中。为了估计肽偶联后的偶联效率，测量该样品在280nm处的吸光度。（该方法假设肽在280nm处吸收，可以使用检测肽的存在的其他波长与单独的偶联缓冲液）。
C. 磁珠准备
小心地将8mL 磁珠移入玻璃瓶，磁分离，移除上清液。加入10ml偶联缓冲液平衡磁珠。磁分离，去除上清，磁珠备用。
D. 肽偶联
1) 在打开前将EDC样品瓶平衡至室温，以避免水分凝结到样品瓶中。
2) 将2mL制备的肽样品加入磁珠中，轻轻颠倒混合样品/磁珠浆液数分钟。
3) 将0.5mL偶联缓冲液加入60mg EDC中。
注意：EDC对水分敏感，当溶解在水性缓冲液中时会迅速水解。为获得最佳效果，请将干粉试剂密封在-20°C的干燥剂中密封在其原始样品瓶中。在使用前立即快速溶解所需量的试剂，并丢弃任何未使用的溶液。
4) 在EDC溶解后，立即将0.5mLEDC溶液加入步骤2的样品/磁珠浆液中。在室温下轻轻混合反应浆3小时。
5) 磁分离，移除上清液。加入2mL洗涤液，磁分离，收集上清液。将两部分上清液混合，用于测定偶联效率。
注意：收集的样品（~4mL）含有未结合的肽。为了测量偶联效率，比较该溶液与起始肽样品的吸光度，考虑2倍稀释效应。
6) 向磁珠中加入2mL洗涤液，洗涤三次。
7) 磁分离后的磁珠，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）或含有0.05％叠氮化钠的其它合适缓冲液平衡，4℃下保存。
3. 通过5'-磷酸基团固定核酸或寡核苷酸的方法
注意：每1μg待偶联的寡核苷酸使用1μL凝胶（4μL混合浆液）。
• 0.1M咪唑，pH6
• 超纯DNase和/或RNase水
B. 核酸或寡核苷酸偶联
1) 混合Magarose-NH2浆液，以获得均匀的磁珠悬浮液。使用移液枪将适量的磁珠转移到微量离心管中。
2) 磁分离并弃去上清液。
3) 用2个磁珠沉降体积的超纯水清洗磁珠3-5次，磁分离并每次除去上清液。
4) 对于每微升使用的磁珠，在1μL的0.1M咪唑（pH6）中溶解至多10μg的DNA或RNA。
5) 将核酸溶液加入凝胶中并充分混合。
6) 称取1mg 的EDC并溶解在67μL的0.1M咪唑中（pH6）。
7) 对于每微升磁珠，加入2μL的EDC溶液。
8) 在室温下摇动或混合反应3小时。
9) 磁分离并除去含有未结合核酸的上清液。
10) 用2个磁珠体积的水或适当的洗涤液（例如Tris-EDTA）洗涤磁珠3-5次，离心并每次弃去上清液。
