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一、概述
Strep-Tag系统是模拟链霉亲和素-生物素系统的新型蛋白纯化系统，Strep-Tactin 对Strep-Tag II的亲和能力与链霉亲和素相比，至少强10倍以上，且分离纯化条件温和，在生理条件下即可实现蛋白的分离纯化；此外，与其他tag相比，Strep-Tag II为8个氨基酸的小标签（WSHPQFEK），由于标签小，仅为1 kDa左右，不影响融合后蛋白质的结构和功能。这些温和的纯化参数能保存蛋白质的生物活性，并仅经一步提取即可产出超过99%的纯度。Magarose-Strep-Tactin磁珠采用特殊的蛋白偶联工艺，将Strep-Tactin蛋白共价偶联到超顺磁性琼脂糖磁珠表面，制备了一种专为高效、快速分离纯化Strep-tag II蛋白的一种新型功能化材料，实现并搭建了提取速度、提取量及纯度兼得的蛋白纯化平台。
二、产品特性
产品名称
Magarose- Strep-Tactin
货号
PMAG003
磁珠浓度
25% (v/v) in 1×PBS (0.1% Tween-20+0.05% NaN3)
配基密度
~6 mg Strep-Tactin /ml磁珠
介质
6%交联磁性琼脂糖
粒径
20-45μm
配体结合
~7 mg Strep-tag II蛋白/ml磁珠
保存
2~8℃保存一年
注：磁珠蛋白结合量与目标蛋白特性相关，此处仅作参考值。
三、使用方法
1. 适用范围
可用于从任何表达系统，包括杆状病毒、哺乳动物细胞、酵母和细菌中含有Strep-Tag II标签蛋白的分离纯化。
2. 操作流程
目标蛋白与磁珠的结合性能将直接影响目标蛋白的纯化效率，各种缓冲液配制也将在一定程度上影响目标蛋白的回收率和纯度。以下提供一个较为广泛应用的Strep-Tag II蛋白的纯化流程，用户可参考该操作流程，或者根据自己蛋白的特性自行设计和优化蛋白纯化流程。
2.1 缓冲溶液配制
Binding/Washing Buffer ：10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8.0；
Elution Buffer：2.5 mM desthiobiotin in Binding Buffer；
Regeneration Buffer: 0.5 M NaOH or 1 mM HABA in Binding Buffer；
2.2 样品处理
本《用户手册》提供以下三种样品的处理方法：
(1) 大肠杆菌、酵母等细胞内表达蛋白：表达细胞用适量Binding Buffer稀释，加入蛋白酶抑制剂（如终浓度为1 mM的PMSF）；冰浴超声裂解细胞，即为粗蛋白样品。如果样品过于粘稠，可根据需要在粗样品中加入适量核酸酶，在冰上放置30 min，以降解核酸。另外，如果目标蛋白含量较低，建议将粗蛋白样品进行离心操作。
(2) 胞外表达蛋白：取胞外表达上清，用等量Binding Buffer稀释平衡，即为粗蛋白样品。
(3) 动物细胞胞内表达蛋白：取适量动物细胞，用适量PBS洗1次，弃上清；用适量含1%（v/v） Triton X-100或1%（v/v）NP-40的Binding Buffer重悬；加入蛋白酶抑制剂（如终浓度为1 mM的PMSF）；置于冰上10 min，即为粗蛋白样品。
2.3 磁珠预处理
一般情况下，磁珠用量由用户根据目标蛋白产量和磁珠载量计算获得。如：采用大肠杆菌表达某目标蛋白，250 mL发酵液收获1 g湿重的菌体，通过预实验估算其目标蛋白产量为~7 mg，用户需要取4 mL 25%的磁珠悬液用于目标蛋白的纯化。以下即以此为例进行详细说明：
(1) 将磁珠置于漩涡混匀器上充分混匀，用移液器取10 mL磁珠悬液于离心管中；
(2) 将离心管置于磁性分离器上，移去上清液；
(3) 加入5~10 mL Binding Buffer/Washing Buffer到上述装有磁珠的离心管中，盖紧盖子，漩涡振荡15 s，使磁珠重新悬浮。将离心管置于磁性分离器上，磁性分离，移去上清液，重复洗涤2次。
（注：磁分离过程中，为减少磁珠使用过程中损耗，待溶液变澄清后，盖紧离心管盖子，保持离心管仍在磁分离器上，手持磁分离器与离心管上下翻转数次，用澄清溶液涮洗离心管盖上残留的磁珠，静置片刻，使溶液重新澄清；以下同。）
2.4 目标蛋白与磁珠结合
(1) 用10 mL Binding Buffer重悬1 g湿重的菌体，进行破碎和裂解后，即为粗蛋白样品；
(2) 将粗蛋白样品转移到装有已预处理磁珠的离心管中，盖紧离心管盖；
(3) 将离心管置于漩涡混匀器振荡15 s，然后将其置于垂直混合仪上，室温垂直混匀30 min（如果需要，可在2~8℃的低温环境下旋转混合约1 h，防止目标蛋白降解）；
(4) 将离心管置于磁性分离器上进行磁性分离，移出上清液到新的离心管中以备后续检测。从磁性分离器上取下离心管进行下一步洗涤步骤。
2.5 磁珠洗涤
(1) 将步骤4的磁珠中加入5~10 mL Washing Buffer，漩涡混合2 min，磁性分离，移出清洗液到新的离心管中，以备取样检测；
(2) 继续将上述磁珠中加入5~10 mL Washing Buffer，漩涡混合2 min，使磁珠重新悬浮，将磁珠悬液转移至新的离心管，避免原离心管壁上非特异性吸附蛋白污染目标蛋白；磁性分离，移出上清液到收集管，以备取样检测；
2.6 目标蛋白洗脱
(1) 加入2~5 mL Elution Buffer（用户根据需要改变洗脱体积调整目标蛋白浓度）于离心管中，盖紧离心管盖，将离心管置于垂直混合仪上，室温垂直混合洗脱10 min；磁分离，收集洗脱液到新离心管中，即为纯化的目标蛋白样品；
(2) 如需要，可重复上述步骤1次，收集样品到新离心管中，以检测目标蛋白是否洗脱完全。
2.7 磁珠再生和保存
(1) NaOH再生：洗脱目的蛋白后的磁珠按照以下顺序进行洗涤： 5~10 mL纯化水洗涤3次、5~10 mL 0.5M NaOH 洗涤3次、5~10 mL纯化水洗涤至中性，最后加入10 mL保存液，将磁珠放置2~8℃环境保存。
(2) HABA再生：用脱硫生物素洗脱目标蛋白后的磁珠，还可用HABA缓冲液再生，加入5~10 mL 1mM HABA洗涤磁珠5次，接着用Binding Buffer洗磁珠至本身颜色，每次洗5 min，最后加入4 mL 保存液，将磁珠放置2~8°C保存。
3. 蛋白纯化流程的优化
以上操作流程适用于大部分Strep-Tag II标签蛋白的纯化，根据目标蛋白与磁珠的结合性能不同，用户可从以下方面对纯化流程优化，以提高目标蛋白回收率和纯度。
3.1 提高目标蛋白回收率的参考方法
(1) 延长蛋白溶液与磁珠孵育的时间；
(2) 添加合适蛋白酶抑制剂，防止目标蛋白降解；
(3) 增加磁珠用量；
(4) 延长洗脱目标蛋白的时间或增加洗脱次数；
3.2 提高目标蛋白纯度的参考方法
(1) 在纯化过程中添加合适的蛋白酶抑制剂，防止目标蛋白降解；
(2) 延长洗涤的时间，增加洗涤次数；
