第二节        基因组DNA的分离与纯化

一、分离与纯化的方法

双链DNA因固有的结构特点，是一种惰性很强的化学分子，可用于重现犯罪现场和进行古生物学分析。但由于是很长的线性分子（如人的染色体DNA平均长度为100～150Mb）而且缺乏横向的稳定性，因此很容易断裂。在溶液中，由于碱基堆砌力的相互作用与磷酸基团的静电排斥作用，DNA分子非常粘稠，沉淀后很难溶解，而且也增加了它对剪切力的敏感性。即便是最轻柔的方式，高分子量的DNA也很容易因剪切力发生横向的断裂。常规方法分离基因组DNA时，大于150kb的DNA分子很容易发生断裂。

（一）酚抽提法

本法最初于1976年由Stafford及其同事提出，通过改进，以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶的裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要行透析或沉淀处理，获得所需的DNA样品。

其中，EDTA为二价金属离子螯合剂，可以抑制DNA酶的活性，同时降低细胞膜的稳定性；SDS为生物阴离子去垢剂，主要引起细胞膜的降解并能乳化脂质和蛋白质，与这些脂质和蛋白质的结合可以使它们沉淀，其非极性端与膜磷脂结合，极性端使蛋白质变性、解聚，所以SDS同时还有降解DNA酶的作用；无DNA酶的RNA酶可以有效水解RNA，而避免DNA的消化；蛋白酶K则有水解蛋白质的作用，可以消化DNA酶、DNA上的蛋白质，也有裂解细胞的作用；酚可以使蛋白质变性沉淀，也抑制DNA酶的活性；pH8.0的Tris溶液能保证抽提后DNA进入水相，而避免滞留于蛋白质层。

多次抽提可提高DNA的纯度。一般在第三次抽提后，移出含DNA的水相，作透析或沉淀处理。透析处理能减少对DNA的剪切效应，因此可以得到200kb的高分子量DNA。沉淀处理常以醋酸铵为盐类，用2倍体积的无水乙醇沉淀，并用70%的乙醇洗涤，最后得到的DNA大小在100kb～150kb。

运用该法可以从单层或悬浮培养细胞、新鲜组织及血液标本中制备少于10mg至大到数百mg的DNA样品。由于分离纯化的每一步都有剪切力的影响，最后得到的DNA样品中分子量超过100kb～150kb的很少，但这种大小的DNA足以作为PCR反应的模板和进行Southern blotting分析以及构建以λ噬菌体为载体的基因组DNA文库。从5×10⁷个培养的非整倍体哺乳动物细胞（如HeLa细胞）大约可以制备分子量在100kb～150kb的DNA 200mg，自20ml血液可得250mg。

（二）甲酰胺解聚法

为构建高容量载体的DNA文库和进行分子量巨大的DNA片段的脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）分析，需要制备分子量大于200kb的DNA。该法的细胞裂解与蛋白质水解同酚抽提法相似，但不进行酚的抽提，而是以高浓度的甲酰胺裂解DNA与蛋白质的复合物（即染色质），然后通过火棉胶袋的充分透析以除去蛋白酶和有机溶剂。甲酰胺是一种离子化溶剂，既可以裂解蛋白质与DNA的复合物，还可使释放的蛋白质变性。但甲酰胺对蛋白酶K的活性无显著影响。本法因操作步骤少，尤其省却了酚的多次提取，所得DNA分子量一般可以大于200kb。

（三）玻棒缠绕法

缠绕法适于同时从不同的细胞或组织标本中提取DNA。与前两个方案不同，它有两个关键步骤：一是基因组DNA沉淀于细胞裂解液与乙醇液的交界面；二是要将沉淀的DNA缠绕于带钩玻棒上。通过带钩玻棒将高分子量DNA沉淀从乙醇溶液中转移到pH8.0的TE溶液重溶。小的DNA片段与RNA不能有效形成凝胶状线卷。该方案以盐酸胍裂解细胞，制备的DNA分子量只有大约80kb，不能有效构建基因组DNA文库，但用于Southern杂交和PCR反应可以获得很好的结果。

（四）DNA样品的进一步纯化

纯化的方法包括透析、层析、电泳及选择性沉淀等。其中电泳法简单、快速、易于操作、分辨率高、灵敏度好、易于观察及便于回收，在DNA的进一步纯化中占有重要的地位。由于聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）与琼脂糖凝胶（agarose gel）可以制成各种形状、大小和孔径不一的支持体，并可以在多种装置中进行电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）与琼脂糖凝胶电泳（AGE）广泛用于核酸的分离、纯化与鉴定。

二、DNA片段的回收

通过凝胶电泳，我们可以对各种大小与来源的DNA片段进行分离、纯化与鉴定。目前，琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶是最常使用的电泳支持体，电泳分离的DNA处于凝胶的三维网状结构中。下面介绍从琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段的主要方法。

（一）总的原则与要求

无论采用何种方法从何种支持介质中回收DNA片段，都要注意两个原则。一是要提高DNA片段的回收率；二是要去除回收DNA样品中的污染。

回收的DNA样品往往因支持介质的不纯、回收溶液的使用及不慎操作等因素而引入污染，这些污染可能严重影响后继的实验。根据实验要求，应对回收的DNA样品进行纯化，以除去污染物。常用的纯化方法包括有机溶剂抽提法与商品化的柱层析法。其中柱层析法采用阴离子交换层析的原理，主要是利用带负电荷的DNA在低离子强度的缓冲液中与阴离子交换树脂结合，洗去杂质，然后再用高离子强度的缓冲液洗脱下来。上述两种纯化方法以及其它回收DNA片段的方法，最终均要在有盐的情况下进行乙醇沉淀，并以70%的乙醇除去有机分子与共沉淀的盐。

（二）从琼脂糖凝胶中回收DNA片段

从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法主要包括二乙基氨基乙基（diethyl aminoethyl，DEAE）纤维素膜插片电泳法、电泳洗脱法、冷冻挤压法及低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法等。

1．DEAE纤维素膜插片电泳法  DEAE纤维素是一种阴离子交换纤维素，可以结合带负电荷的DNA分子。将DEAE纤维素膜插入到经琼脂糖凝胶电泳分离的核酸条带前，继续电泳直至所需回收的DNA片段刚好转移到膜上。取出DEAE纤维素膜，低盐条件下洗去杂质，高盐条件下洗出DNA分子。该法操作比较简单，可同时回收多个DNA片段，对500bp～5kb的DNA片段回收率好，纯度高，能满足大多数实验的要求。但DNA片段大于5kb时，因结合力增大而回收率下降。至10kb或为单链DNA时，其与膜的结合变得很牢固而难以回收。因此，本法不适合于分子量大于10kb的DNA片段的回收，也不能回收单链DNA。

2．电泳洗脱法  电泳洗脱法包括两个主要步骤，一是将待回收的DNA片段电泳出凝胶介质，使其进入一个便于回收的小容积溶液中；二是分离纯化出DNA片段。按是否使用透析袋可分为透析袋电泳洗脱法与非透析袋电泳洗脱法两大类。其中，透析袋电泳洗脱法需要切下含待回收DNA片段的凝胶条，然后放入透析袋内进行电泳，使DNA分子迁移出凝胶条进入透析袋的溶液中，最后经抽提纯化回收DNA分子。该法操作很不方便而且不适合于同时回收大量不同的DNA片段，但可有效回收从200bp至大于50kb的DNA，尤其对大于5kb的DNA有良好的回收率。

3．低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法  该法是从低熔点琼脂糖凝胶中切出含待回收DNA的凝胶块，利用其纯度高、熔点低（65℃）及凝固温度低（30℃）的特点，在室温大于30℃，琼脂糖仍为液态的情况下，对DNA片段进行回收的方法。根据不同的提取纯化方案，又可分为有机试剂提取法、玻璃珠（或玻璃粉）洗脱法和琼脂水解酶（agarase）法。有机试剂法以酚、氯仿抽提DNA，可以有效回收0.5kb～5kb的DNA片段。玻璃珠（或玻璃粉）洗脱法是将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化钠（NaI）溶液或高氯酸钠溶液中，然后加入玻璃珠（或玻璃粉）以结合DNA，经分离、洗涤后，在低盐缓冲液中将DNA洗脱下来。玻璃珠（或玻璃粉）洗脱法较有机试剂提取法快，但回收率略低。琼脂水解酶法对切下的含DNA的凝胶块进行消化，将琼脂糖水解为二糖，释放的DNA用酚抽提，乙醇沉淀回收。

目前，有许多能从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法与改良方案，但至今尚无一种方法既能有效回收DNA大片段或微量的DNA片段，又能同时回收几种DNA片段并有效去除凝胶中酶促反应抑制剂（如多糖类）。每种方法各有其特点，各有其适用范围，应根据不同的要求选择不同的方法并对某些步骤做出相应的调整。

（三）从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段

从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA的标准方法是压碎与浸泡法。它是将含待回收DNA条带的凝胶块切出，用吸头或接种针将其压碎，然后以洗脱缓冲液浸泡，使DNA洗脱出来。该法能很好回收小于1kb的单链或者双链DNA，且纯度很高，无酶抑制剂，也无对转染细胞或微注射细胞有毒的污染物，虽费时但操作简单，是小片段DNA回收的较好方法。依分子量不同，其回收率从小于30%至大于90%不等。如果将切下的聚丙烯酰胺凝胶块包埋于琼脂糖凝胶中，再进行DEAE纤维素膜插片法电泳或透析袋电泳洗脱，可以缩短双链DNA的回收时间。

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三、基因组DNA分离纯化的方法学评价与质量保证

 

有关基因组DNA分离纯化的方法很多，每一种方法下又可衍生出许多具体的实验方案。对每一个具体的实验方案，大体上我们可以从方法的可行性与可靠性两个方面来加以考察。可行性方面包括方法是否简便、快速、安全及成本如何。可靠性则包括了方法的稳定性、重复性、特异性、产出比、最大产量及最小样品用量等。另一方面，由于酚具有高度的腐蚀性，需要采取特别的安全防护措施。