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漫谈核酸的提取和纯化之三:质粒DNA的提取与纯化

2017-6-22 9:21:21点击:

第三节        质粒DNA的提取与纯化


大多数质粒都是双链的共价闭合环状质粒(CCC plasmidDNA,简称闭环质粒(closed circular plasmidCC plasmid)。作为携带外源基因在细菌中扩增或表达的重要载体(vector),质粒在基因工程中应用十分广泛。有关质粒的提取与纯化是必须掌握的基本技术。

一、提取与纯化的方法

质粒DNA的提取与纯化的方法很多,经典的方法包括碱裂解法、煮沸裂解法、SDS裂解法等。这些方法主要由细菌的培养(质粒DNA的扩增)、细菌的裂解(质粒DNA的释放)及质粒DNA的分离与纯化等三个步骤组成。按制备量的不同,质粒DNA提取与纯化的方法可分为质粒DNA的小量(1ml2ml)制备、质粒DNA的中量(20ml50ml)制备及质粒DNA的大量(500ml)制备。


(一)碱裂解法

碱裂解法简单、重复性好而且成本低,是使用最广泛的方法。在NaOH提供的高pH12.012.6)条件下,用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁,裂解细胞,与NaOH共同使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性,释放出质粒DNA。尽管碱液能破坏核酸的碱基配对,但CCC质粒DNA因缠结紧密而不会解链。只要不在碱性条件下变性太久,当pH调至中性时,CCC质粒DNA就可重新恢复其天然状态。裂解后,细胞壁碎片与变性的蛋白质和染色体DNA形成大的复合物,这些复合物在高钾盐条件下,可有效沉淀,而质粒DNA保留于上清中。直接通过无水乙醇沉淀质粒DNA,并用70%的乙醇洗涤,其纯度可满足DNA测序与PCR等实验的要求。

碱裂解法是一种适用范围很广的方法,能从所有的大肠杆菌(E.coli菌株中分离出质粒DNA,制备量可大可小。


(二)煮沸裂解法

煮沸裂解法是将细菌悬浮于含Triton X-100和溶菌的缓冲液中,Triton X-100和溶菌破坏细胞壁后,沸水浴裂解细胞的同时可破坏DNA链的碱基配对,并使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA变性,但CCC质粒DNA因结构紧密不会解链。当温度下降后,CCC质粒DNA可重新恢复其超螺旋结构。通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA,然后回收上清中的质粒DNA

煮沸裂解法是一种条件比较剧烈的方法,对于大质粒(>15kb)有明显的剪切作用,故只能用于小质粒DNA<15kb)的制备。该法能用于小质粒DNA的小量与大量制备,并且适用于大多数的E.coli菌株。由于糖类很难去除,而且糖抑制限制性和聚合的活性,故该法不适用于在去污剂、溶菌和加热情况下可释放大量糖类的E.coli菌株,如HB101及其衍生菌株(TG1)。另外,煮沸不能完全灭活核酸内切Aendonuclease AendA)的活性,故表达endA的菌株亦不适用于本法。在细菌培养过程中,加入氯霉素可抑制细菌的蛋白合成和细菌分裂,有利于质粒DNA的选择性扩增。


(三)SDS裂解法

大于15kb的质粒DNA容易因细胞裂解和后继操作而遭到破坏,因此需要温和的裂解方法。SDS裂解法是将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中,用溶菌EDTA处理以破坏细胞壁,去壁细菌再用SDS裂解,从而温和地释放质粒DNA到等渗液中,然后用酚/氯仿抽提。

由于条件温和,SDS裂解法有利于大质粒DNA的提取。但该法在处理过程中,有一部分质粒DNA因缠结在细胞碎片上而丢失,故产率不高。


(四)其它方法

其它方法如小量一步提取法、牙签少量制备法及Triton-溶菌法等,各有特点与适用范围。小量一步提取法,直接将酚/氯仿与细菌培养物混合,同时完成细胞裂解与蛋白质变性两个过程,然后离心去除大部分胞核DNA与蛋白质,最后从上清中回收质粒DNA。该法简单快速、经济可行,可用于内切图谱分析。


(五)质粒DNA的纯化

目前,关于纯化的方法与方案非常多,都利用了质粒相对较小和共价闭环的结构特点。其中,纯化效果好而且适用范围广的方法主要有氯化铯-溴化乙锭等密度梯度超速离心法(简称CsCl-EB法)、聚乙二醇沉淀法和柱层析法。

1CsCl-EB  CsCl-EB法是一种沉降平衡离心法,经超速离心,离心介质CsCl形成一连续的密度梯度,在过量EB存在的条件下,各种不同密度的物质经离心平衡后得以分开。其中蛋白质密度小(1.3 g/cm31.4g/cm3),浮于液面;RNA密度大(2.0g/cm3),沉于管底;各种DNA密度介于蛋白质与RNA之间,处于中部。过量EB处理前,细菌染色体DNA与不同分子构型的质粒DNA的密度均为1.7g/cm3左右,难以区分。经过量EB处理后,不同分子构型的DNAEB的结合能力不一样,因而密度下降不一致,可有效分离。其中,闭环质粒DNA为超螺旋三级结构,EB不易插入,结合量少,密度下降小,约为1.59 g/cm3;而染色体DNA、开环质粒DNA以及带切口的环状质粒DNA可以嵌入更多的EB,密度下降较多,约为1.54 g/cm3,从而能与闭环质粒DNA分开。回收的闭环质粒DNA含有嵌入的EB,可采用有机溶剂抽提法或离子交换层析加以去除。经典的CsCl-EB法由于其容量大、分辨率高、纯化效果好,至今仍是质粒DNA纯化的标准方法。但该法很费时并需要昂贵的设备与试剂。


2.聚乙二醇沉淀法  聚乙二醇(polyethylene glycolPEG)沉淀法是一种分级沉淀法。质粒DNA的粗制品首先用LiCl沉淀大分子RNA,并用RNase消化小分子RNA;然后在高盐条件下,用PEG选择性地沉淀大的质粒DNA;沉淀的质粒DNA进一步用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀。该法简单、经济、适用广,尤其对碱裂解法提取的质粒纯化效果好,适用于分子克隆中所有常规的学反应,也能用于高效的哺乳动物细胞的转染。但PEG法不能有效分离带切口的环状质粒DNA与闭环质粒DNA


3.柱层析法  柱层析法纯化质粒DNA的关键是其填充的树脂。大体上,树脂可分为两类:一类是利用疏水的相互作用来纯化质粒DNA样品;一类则通过离子交换与吸附的相互作用进行纯化。以硅基质作为填充材料的柱层析,其作用原理是在多盐条件下,依靠DNA与硅基质的可逆性结合来进行纯化。多盐造成磷酸二酯骨架的脱水,通过暴露的磷酸盐残基,DNA吸附到硅基质上,以50%的乙醇溶液洗去RNA和糖类等生物大分子,然后加入TE或水溶液使DNA分子重新水合,并通过离心洗脱出来。DNA与硅基质的吸附作用与DNA的碱基组成和拓扑结构无关,因此可用于环型质粒DNA和线性DNA的纯化。小于100bp200bpDNA分子由于与硅基质的吸附力很弱,不能用于小分子DNA片段的纯化。但在纯化大分子DNA时,可有效去除小分子DNA的污染。

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