He, W., Wu, W., Li, Y., Liu, Q., Ren, P., Liu, H., & Chen, F. (2025). Next generation nanoparticle protein corona characterization methods. Nanomedicine, 1–3. https://doi.org/10.1080/17435889.2025.2460962

        纳米颗粒 （NP） 因其独特的特性而彻底改变了医学、电子和材料科学。然而，生物医学应用中的一个关键挑战是蛋白冠 （PC） 的形成，这会影响 NP 在体内的行为和功效，NPs 在各种介质中的演变和意外暴露过程中 PC 的意外形成对纳米颗粒的毒性和安全性有重大影响。由低亲和力软蛋白冠和高亲和力硬蛋白冠组成的 PC 响应生物环境而发生动态变化，使纳米粒子相互作用的可预测性复杂化。因此，开发用于 PC 表征的实时方法对于控制和优化 NP 行为、推进个性化医疗和靶向治疗至关重要。

        传统的 PC 表征方法，如凝胶电泳、质谱和表面等离子体共振，为了解蛋白冠的组成和结构提供了有价值的见解，但这些方法通常无法在实时体内条件下捕捉蛋白质-纳米颗粒相互作用的动态和异质性。例如，它们通常依赖于通过离心从培养基中分离 NP 蛋白复合物，这会导致软蛋白冠的损失。因此，这些技术无法完全反映生物系统中的实际 PC“指纹”。

        新一代技术通过实现实时原位分析来避免与分离步骤相关的干扰和蛋白质损失。这些创新可以更准确、更全面地了解 PC 的形成及其与生物系统的复杂相互作用。这一进展的一个主要例子是 Niu 等人的工作，他们开发了一种新颖的原位方法，用于使用纳流式细胞术 （NanoFCM） 在单纳米颗粒水平上定量分析纳米颗粒-蛋白质相互作用，通过整合双荧光定量技术，NanoFCM 可以提供有关血清等复杂生物基质中蛋白质吸附动力学和纳米颗粒聚集的实时数据。这种方法使研究人员不仅可以监测蛋白质吸附，还可以监测人血清中纳米粒径的演变。这代表了纳米颗粒-蛋白质相互作用的定量、原位表征的重大进步，有望为设计更有效的纳米药物提供有价值的见解。Zentel 等人使用不对称流场-流式分离从人血浆中分离 PC/NP 复合物，并使用 SDS-PAGE 和无标记蛋白质组学表征富集的蛋白质。这种方法可以防止离心过程中的 PC 损失。结果表明，尽管在大多数情况下有效缓解 PC 形成存在挑战，但并非所有纳米颗粒都会发展出显著的 PC。具体来说，PEG、pSar 和 pHPMA 包被的聚合物纳米载体表现出最小的蛋白质吸附，解释了它们延长的循环时间和潜在的临床应用 。

       对软 PC 成分的实时分析提出了一个重大问题。由于时间尺度较长，以前的方法无法精确捕捉其动态变化。值得注意的是，Zhang 等人在纳米颗粒中开发了一种纳米粒子光催化接近标记 （nano-PPL） 技术，用于 PC 的原位标记，并在二级研究了 PC 的快速形成机制，纳米 PPL 技术利用载有 Ce6 催化剂和生物素-酚探针的核壳纳米颗粒进行快速、精确的原位 PC 标记。与传统离心法（>30 秒）相比，纳米 PPL 显著提高了纳米粒子-蛋白质相互作用的时间分辨率，持续时间精度低至约 5 秒。作者发现，照射光敏探针 Ce6 可以激活生物素酚，从而诱导蛋白质的生物素化。自由基转移是邻近标记的基本原理。因此，活化的生物素酚可以自由基的形式与周围的蛋白质反应，并将生物素标记附着在它们上面。最后，这些生物素标记的蛋白质可以使用链霉亲和素包被的磁珠进行分离，并通过液相色谱和串联质谱进行鉴定和定量。在另一项研究中，研究人员使用 IRDye 680 NHS 酯快速标记蛋白质以对 PC 进行体内追踪，从而能够观察其动态变化，原子力显微镜具有纳米级分辨率，特别适合分析单分子生物共轭过程。这两种技术的集成在 PC 动力学的原位监测方面具有巨大的潜力，可能代表一种很有前途的下一代表征方法。

        在另一项研究中，Baimanov 等人开发了一种基于生物层干涉法 （BLI） 的快速捕鱼策略，为纳米颗粒表面的 PC 建立了一种原位和动态分析方法，一旦手性 NP 与其连接，IgG 预包被的生物传感器在生物样品中孵育以形成 PC。用不同浓度的洗涤缓冲液洗脱和分离软 PC 和硬 PC 的蛋白质，并通过质谱鉴定。这种方法允许实时监控 PC 的形成、交换和解离过程。通过对多层 PC 的组分进行原位和快速洗脱，它实现了软硬 PC 的高效分离、鉴定和时间分辨动力学研究。这种原位分析方法也适用于超小、低密度纳米颗粒的 PC 研究。此外，该研究团队系统总结了过去几年开创的纳米 PC 分析和表征方法，并将其汇编成一本详细而全面的实验手册，优化的工作流程涵盖了所有过程，例如纳米生物分子蛋白冠的形成、制备、定量、成分鉴定、原位表征和动态相互作用。该技术解决方案结合了多种不同的分析方法，例如电子显微镜、质谱、同步辐射分析方法、分子相互作用分析和分子动力学模拟，有助于全面和系统地表征纳米生物分子蛋白冠的物理化学性质、成分和原位动力学相互作用。该实验手册详细总结了上述分析方法的优化实施方案，为纳米生物分子蛋白冠的综合分析提供了有价值的研究策略。它不仅适用于阐明纳米生物分子蛋白冠的形成、进化和动态相互作用过程，而且为揭示纳米生物界面对纳米材料复杂的化学和生物效应的机制提供了有效的研究工具，在纳米科学、生物医学、毒理学和环境科学等众多研究领域具有重要的应用价值。

        PC 的体内表征长期以来一直是一个基本未被探索的领域，但它在确定 NP 在生物系统中的行为方面起着至关重要的作用。最近，Latreille 等人提出了一种新的理论框架，用于定量评估蛋白质对 NPs 的原位吸附，并在荧光成像模式下使用差分动态显微镜 （DDM） 监测 NPs 的聚集 [DDM 可以同时监测 NP 的大小和聚集，通过量化这种聚集，它可以应用于复杂的蛋白质混合物。结果表明，蛋白质吸附可以触发颗粒聚集，并且该方法可以进一步量化形成的聚集结构。研究表明，蛋白质对聚苯乙烯 NPs 的亲和力与颗粒浓度有关。对于复杂的蛋白质混合物，本研究发现 PC 的组成随血清蛋白的稀释而变化，从而证明了从未在 NP 上原位定量评估过的 Vroman 效应。实验结果表明，DDM 可以监测 PC 在体内的变化。斑马鱼幼虫中 PC 的组成随着时间的推移发生显着变化，进一步证实了 PC 的动态性质。本文为纳米颗粒与生物分子相互作用的研究提供了一种新的定量分析工具，实验验证了其在体外和体内应用中的有效性，为纳米医学的发展提供了重要的参考。尽管 DDM 在研究纳米颗粒和蛋白质之间的相互作用方面具有显着优势，但它也面临着一些限制，例如高浓度样品、非球形颗粒、荧光猝灭、动态范围、实验条件和数据处理方面的挑战。在应用 DDM 时，应根据具体的研究对象和条件进行适当的调整和优化。

      使用计算机模拟预测纳米材料上的 PC 的研究是一个活跃的研究领域。Huzar 等人表明 DNA 纳米结构的工程改造可以通过非 DNA 修饰来实现，并且在较小程度上可以通过改变 DNA 结构本身来实现，他们的机器学习模型在预测蛋白质吸附在 DNA 纳米结构上的准确率达到了 92%。该 AI 工具可帮助研究人员预测蛋白冠组成，优化生物物理和生物医学应用的 DNA 纳米结构设计。然而，需要对高分辨率成像和生化分析进行进一步研究，以补充机器学习预测。

       用于 PC 的下一代表征方法的开发为推进纳米医学和纳米生物技术领域带来了巨大的前景。然而，这些下一代表征技术的开发必须解决几个关键挑战。这些挑战包括克服高成本带来的限制、对先进设备的需求以及实时捕获动态变化的困难。此外，体内 PC 的原位检测仍然是一项艰巨的挑战。为了解决这些障碍，各种新兴技术的组合，如实时成像、多模态传感和先进的计算工具，有望带来突破。另一个重要的考虑因素是来自各个领域的研究人员之间需要跨学科合作，包括纳米材料、生物学、物理学和计算科学。此类合作对于开发更有效和通用的表征技术至关重要。随着我们朝着这个方向前进，不同技术的整合无疑将增强我们对 PC 的理解，从而为针对广泛疾病的更加个性化和有针对性的治疗铺平道路。普睿迈格提供蛋白冠富集磁珠 http://www.purimagbead.com/Product/8096211554.html