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链霉亲和素在生物诊断中应用简介

2018-1-5 20:53:24点击:
一、链霉亲和素性质
链霉亲和素streptavidin,SA)是由链霉菌streptomyces avidinii分泌的一种蛋白质,分子量为54kD。链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成,其氨基酸组成中,甘氨酸和丙氨酸的含量较大,而且结合生物素的活性基团也是肽链中的色氨酸残基;链霉亲和素是一种稍偏酸性(pH6.0)的蛋白质,并且不带任何糖基。

链霉亲和素分子中每条肽链都能结合一个生物素,因此与亲和素一样,一个链霉亲和素分子也能结合4个生物素分子,二者亲和常数(K)亦为1015L/mol。在蛋白水解作用下,链霉亲和素可在N端10~12和C端19-21间断裂,形成的核心链霉亲和素仍然保持完整的结合生物素的能力。链霉亲和素的活性单位也是以结合1μg生物素所需的量来表示,1mg链霉亲和素的最高活性可达18U。

 
二、亲和素(AV)和链霉亲和素SA)的比较
相同点
1、 生物素结合能力:AV:13~15U,SA:14~18U
2、 活性中心依赖于色氨酸-懒氨酸:亲和素在氨基酸序列的70-70和110-111两个位点有色氨酸-懒氨酸,链霉亲和素在氨基酸序列的79-80和120-121两个位点含有色氨酸-懒氨酸。
 
不同点:
1、 分子量:AV=66KD, SA=54KD
2、 等电点:AV=10.5, SA=6.0, AV带正电较多,非特异性结合较强。
3、 位阻效应:SA的生物素结合位点较AV深,位阻效应较强,长臂生物素更适合。
4、 生物素的结合:AV随机结合,SA协同结合。
5、 氨基酸序列:AV含二硫键和10%糖,SA含甘氨酸丙氨酸较多,无糖和二硫键。
 
三、链霉亲和素在ELISA中的应用

联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂:

①固相的抗原或抗体,②标记的抗原或抗体,③作用的底物。

根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件,可设计出各种不同类型的检测方法。


生物素-链霉亲和素系统在ELISA中的应用有多种形式:
1、用于间接包被:可以在固相上先预包被链霉亲和素,原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合,通过链霉亲和素-生物素反应而使生物素化的抗体或抗原间接包被。这种包被法主要有以下优点:
① 增加吸附的抗体或抗原量,而且使其结合点充分暴露。
② 阴性对照、空白对照本底低,检测敏感性高。
③ 链霉亲和素替代抗体包被微孔,避免了抗体包被微孔时容易发生失活(或不易保存)。
④ 通过生物素将抗体结合于链霉亲和素包被的标板上,可克服传统物理吸附方法造成的抗原抗体结合能力大量丧失的不足。

⑤ 生物素标记捕获抗体、标指示抗体和样品中的抗原三者在均相中形成复合物后,再通过生物素结合于链霉亲和素包被的标板上,由于链霉亲和素和生物素之间亲和力极强,并且具有高度的特异性和稳定性,因而可提高检测灵敏度。

实例:CTnT检测实验中,双抗体夹心ELISA法最低检测值为7.25μg/L,使用链霉亲和素包被法最低检测值达到1.0μg/L,较双抗体夹心ELISA法灵敏度提高7倍。

 

2、   用于终反应放大:在常规ELISA中的标抗体也可用生物素化的抗体替代,然后连接亲和素-结合物,以放大反应信号。

由于SA的等电点低,表面带的正电荷少,因此它和聚苯乙烯板载体的静电吸附力弱,SA的阴性对照显色明显比AV低,这样在ELISA上应用SA可进一步提高方法的灵敏度。链霉亲和素对生物素化的抗体是一个主动的吸附过程,生物素化的抗体吸附在链霉亲和素表面,抗体排列整齐,分布均匀,抗体容易保持功能,而被动吸附抗体排列极不规则容易导致大量抗体失去功能,所以将生物素-链霉亲和素免疫反应系统引入竞争法中,可以大大提高联免疫的灵敏度和特异性。

实例1: 地高辛的生物素-链霉亲和素免疫法测定实验中,传统方法被动吸附只有约5% 的抗体具有功能 ,生物素-链霉亲和素体系中60% 的抗体具有功能。
实例2:淋球菌抗原测定方法实验中,生物素-链霉亲和素法检测灵敏度为0.625 μg/L,相当于3.5×104/ml淋球菌,而同时进行常规ELISA测定时,其灵敏度为1.25 μg/L。
 
四、链霉亲和素相关商品
1、 标记化链霉亲和素
或荧光素等修饰链霉亲和素,应用于ELISA放大检测信号,提高检测灵敏度。
产品实例:
① 绿色荧光素(FITC)标记Streptavidin蛋白
② 辣根过氧化物标记链霉亲和素

2、 链霉亲和素标板
链霉亲和素直接或间接预包被在标板上,稳定性高,易于保存,使用时只要加入生物素化的抗体或者抗原即可。

3、 链霉亲和素磁珠
链霉亲和素磁珠由超顺磁微粒与高纯度链霉亲和素共价结合而成。磁珠可用于捕获生物素标记的底物,包括生物素标记的抗原、抗体和核酸。由于生物素-链霉亲和素的相互作用很强,其结合常值(Ka)为 1015 M-1,并且链霉亲和素的非特异性结合率很低,使得被捕获的底物可满足后续实验要求,包括 mRNA 的分离和一抗、二抗的获得。

产品实例:
PuriMag G-Streptavidin链霉亲和素磁珠
产品描述:
亲和素包被的PuriMag G磁珠为分离生物素抗体、核酸或其他生物素配体和靶分子的最佳选择。这种链亲和素-生物素的高亲和力 ( Kd值10-15 )在分子上有着广阔的应用。磁珠是单层而不是多层的链亲和素重组体。这对自由生物素或生物素配体和靶分子而言,在空间排列有着绝大多数的生物素结合位点。没有过量的物理吸附链亲和素确保了只有微量的链亲和素会遗漏。批次间变化小,结果重复性好。
优点和特性:
• 直接快速捕获任何生物素靶分子
• 灵活的固相操作和优化的液相反应动力学
• 磁性操作易于适应自动化平台
• 批次重复性高,结果可靠一致

应用:
PuriMag G-Streptavidin已达到了前所未有的广泛应用。主要应用在制备单链DNA模板,分离RNA和DNA结合蛋白,固定长链DNA片段,纯化测序产品,特效捕获核酸。
浓度:10mg/ml
储存条件:2-8
结合能力:
磁珠的结合能力由DNA片段长度决定。 1mg磁珠结合4,000 pmoles自由生物素,400 pmoles生物素标记的核苷酸(单链) ,10 - 20µg生物素标记抗体和10 pmoles的2 - 4 kb双链DNA片段。
英文名称:PuriMag G-Streptavidin

中文名称:PuriMag链霉亲和素磁珠

更多请参考:http://www.purimagbead.com/Product/8271042221.html