分子生物实验核酸的抽提作为整个生物领域最基础的一个实验，已渐渐被大家所淡忘。市场上的样本处理及抽提方法的越来越多，大家越来越把自己的研究重心，放在下游更为重要的实验。而对于样本的处理和抽提，更多的人选择试剂盒，而很少会考虑到样品本身，或者抽提过程一些遇到的问题。这篇备忘录旨在针对刚开始接触核酸抽提实验的同学做一些简要的介绍，对已常年浸润于分子实验的老鸟们做一些善意的提醒。希望大家在看过这篇备忘录之后，对于不同的样品抽提能有更多的感悟。我这里抛砖引玉，也希望大家不吝赐教。

样品的前处理

      分子实验中需要抽提的主要样本大致分为这几类: 血液、细胞、组织、体液、微生物。核酸的抽提，不同的样本之间存在不一样的特性，在选择抽提方式的时候，也要尽量辨别。例如：

      1. 细胞中植物细胞相较于动物细胞更难裂解，选择裂解液和裂解方式的时候需要格外注意。一般的研磨钵可能对于组织及一般的细胞比较好用，但是植物细胞往往需要使用液氮加机械裂解的方法。

      2. 对于革兰氏阳性菌和真菌还需要加入溶菌酶和蛋白酶来辅助裂解，不然提出来的量真是惨不忍睹。

      3. 食品的样本往往需要特殊的提取试剂盒，不然在深加工的过程中，高温高油脂带来的PCR抑制效果非常明显，市面上Purimag 系列、ThermoFisher的PrepSEQ系列、QIAGEN的Mericon系列等。

      这里想到自己之前遇到过的情况，在裂解神经组织的时候，大部分人可能觉得和一般的组织的抽提并无区别，但是恰恰相反，神经组织作为有髓鞘包裹的组织，在大脑中脂质含量又比较高，所以属于比较难提取的一类组织。个人推荐液使用液氮加机械研磨的方法来预处理样本，并在后续的提取过程中选取相关公司提取脂质的试剂盒来提取。

      说到机械破碎仪，市面上很多公司都有破碎仪销售，方法大致是通过高频率的震荡来使细胞破碎，释放里面的核酸，例如QIAGEN的Tissuelyser系列。这里需要注意的是，超声破碎仪尽量避免使用，高频率的声波会将DNA片段化，影响后续的实验。

抽提方法

      目前市面主要的抽提试剂盒，大致分为三类：磁珠法、沉淀法、柱法。每种方法各有各的优缺点。

      磁珠法提取的片段长度较长，且完整，适用于下游二代测序，基因文库构建等应用。但是，其提取效率与磁珠和核酸的亲和性直接相关，这导致了有时候稳定性不会很好，并且各个厂家的磁珠捕获能力也不尽相同，其中国产的purimag磁珠（www.purimagbead.com）和天根磁珠(www.tiangen.com)都是其中的佼佼者。

      沉淀法以Life的Trizol法为代表，个人感觉应该是目前是使用比较广泛的一种方法。其利用试剂将DNA层，RNA层分开，直观，方便。后期使用异丙醇将DNA，RNA析出并纯化的方法，可以满足绝大多数的分子生物实验。但是缺点往往也由于加入了不少的有机试剂，DNA/RNA分层有时候不易区分，导致了提取出来的核酸纯度不够，造成浓度虚高的假象。很多实验室会自己设计核酸提取步骤，大多数也是基于这个原理，先加入高盐裂解液，然后分离核酸，纯化。

      另外，个人推荐大家关注一家目前市面较为新的一家公司赛佩（Cepheid），前两天刚刚40亿美元被Danaher收购了，他们家的Xpert® 系列，smartcycler等样品处理器，设计与目前市场的其他类产品都不大一样，属于分子诊断界的一股清流。

抽提温度

      一般核酸的抽提操作温度都是常温（15-25摄氏度），这点可能大多数人不会特别注意到。一般在常温离心的时候，离心机转速过快导致离心机内温度升高，以至于机内温度高于了室温的情况也是有的。特别是在提取RNA的时候，过高的操作温度导致RNA降解，还是时有发生。例如在Trizol抽提的时候，有些人会在加入异丙醇让DNA/RNA析出的时候，为了防止温度过高，设置离心机温度为10摄氏度，来抵消离心机温度上升的影响。

离心机转速

      离心机转速看似不是很重要，但是往往很多人会忽略。之前又遇到过RPM和RCF (g) 傻傻分不清的同学，所以给大家简单的复习一下RCF = 1.12×10－5×(rpm)2 r。一般低速离心使用RPM表示而高速使用g。大家抽提的时候可以注意一下转速的要求，往往提高转速或者在转速达不到要求的情况下延长离心时间，会对提取有一定的帮助。

DNA/RNA污染

      其实DNA/RNA污染在抽提的过程中很普遍，例如Trizol抽提时，分层不是很明显，错将一部分DNA吸入RNA的层，也是时有发生。使用柱提法的试剂盒，膜的亲和性并不能完全保证对于DNA/RNA的专一性等情况，都会造成抽提时候的污染。

      其实根据个人下游实验的需求不同，对于DNA/RNA的污染要求也不同。目前市面上的抽提试剂盒，基本不可能保证完全保证抽提的完全纯度，少量的DNA/RNA残留是可以被允许的，不影响大部分的实验。之前遇到过有人拿某品牌RNA的抽提试剂盒，来抽提病毒DNA，抽出的拷贝数RT-PCR检测后能达到10^5个。所以大家在选择购买试剂盒的时候，可以咨询一下技术人员，是否能将DNA或者RNA去除干净。如果下游对于DNA/RNA纯度要求较高，如建库，测序等，需要在抽提过程或者抽提结束后加入相应的DNA酶或者RNA酶消化，纯化。

核酸质量

      目前最流行的方法是nanodrop测量核酸的OD值。通过测量整个溶液的260/280，260/230来确认提取的质量。其中， 280nm是蛋白质的吸收峰, 260nm是NA的吸收峰230nm是有机物的吸收峰，一般是乙醇。所以260/280就是反应提取的蛋白质污染的水平。260/230反应的就是有机污染的水平。一般来说260/280的比值在1.7-2.0之间260/230的比值在1.8-2.1之间，个人经验来说比值上下浮动0.2可以被允许。 过高的260/230也是存在的，之前自己有碰到过提取出260/230大于10的情况，但是后续实验没有影响。个人猜测是酒精去除的较为干净，导致260相对于230很高。如果DNA降解，260/280变高，所以小伙伴们遇到260/280过高的情况就要警惕了。另外一个较为流行的方法是使用Thermo的Qubit或者QIAGEN 的QIAxpert。他们可以分别测量提取的溶液中单链成份和双链成份的比值，测出来更精确，也更直观。

      另外，凝胶电泳分析也往往是必要的。个人建议提取完核酸之后有条件一定要进行凝胶电泳的质量验证。可以看出DNA/RNA的完整性，相对的浓度，还有片段大小是否符合，可以说一个凝胶电泳，可以让我对仪器读出的值，有一个更直观的感受。在这里我也有几点需要提醒大家。第一点是希望大家选择正确的凝胶类型。第二点是希望大家选择正确的跑胶电压，时间还有方向。第三点希望大家点样的时候尽可能的先稀释核酸，过多的核酸会让核酸挤在泳道内,使其完全跑不开。

      可能大家看到这两点会不禁笑出声来，这么基础的东西为什么也需要列举出来。但是，由于个人工作的关系，已经不下10次的遇到电压刚才我提及的三个问题了。在这里个人再做一个提醒，核酸选用琼脂糖凝胶电泳，电压尽量不要超过110V，时间不要超过45分钟就可以了，我们需要看到的仅仅是分开清晰的条带，并不需要把各个条带跑多开。个人经验来说DNA 90v跑15到30分钟就可以有比较漂亮的条带出来了。RNA为了防止降解，可以选择使用140v，5分钟来跑。如果不是很确定自己的条件是否合适，可以观察自己的Marker，如果连marker都在胶板上消失了，可以考虑一下我上面提到的条件。

      在仪器方面，比较经典的仪器是安捷伦的2100可以通过DIN值，还有RIN值来测量DNA和RNA的完整性。测序公司可能会需要两个值大于6才能通过质控，但是经验来说一般的分子实验大于5就可以了。其他仪器还有QIAGEN的QIAxpert系列目前做的也比较好。

核酸抽提仪

      另外，除了上面提到的手动抽提试剂盒，更多的公司选择研发自动化的工作平台。这些平台抽提效率高，抽提重复性好，节省时间，在目前的市场上很畅销。例如对于一些少量样本的处理仪比较有名的如ABI，QIAGEN的QIAcube 24，Promega的 maxwell 16， 天根的Tguide 16。对于高通量的样本有Rocher的 magNA pure 96， QIAGEN的 QIAcube HT, ABI的magmax express 96。另外QIAGEN还有大型工作站QIAsymphony SP/AS 可以将样品制备和PCR体系的构建结合，目前国内唯一。另外,还有一些国产抽提仪，就不一一列举了。这些提取仪特别是基于磁珠法的提取仪均能与purimag的DNA提取磁珠完美配合。

小结

      核酸提取是一个说简单不简单，说复杂不复杂的小型实验。但是实验本身会对我们后续实验产生深远的影响。个人曾见过一些核酸提取质量不过关，导致后续PCR扩增不出来，测序公司质控不通过，RT-PCR扩增效率低等问题。就在刚刚，有人向我抱怨说测序公司退回了他的样品，他的RNA已经降解。而当我问他，“你之前有测过RNA浓度”的时候，他只能张着嘴巴说“我没有测啊”。一句“没有测”，会导致你需要去排查的问题，从原来只需要检查运输储存条件和提取的耗材问题，增加到从提取开始的大型troubleshooting，最后问题还不一定能够完全解决。

       厦门普睿迈格生物科技有限公司提供的DNA/RNA核酸提取磁珠产品请参考 http://www.purimagbead.com/Product/267584288.html