Saei, A. A., Sun, L., & Mahmoudi, M. (2024). The role of protein corona in advancing plasma proteomics. Proteomics, e2400028. https://doi.org/10.1002/pmic.202400028

摘要：蛋白冠是生物环境中围绕纳米颗粒形成的生物分子层，严重影响纳米颗粒与生物系统的相互作用，影响药代动力学和生物结果。最初，蛋白冠给纳米医学和纳米毒理学带来了挑战，例如细胞培养物中的营养消耗和纳米颗粒靶向物种的掩盖。然而，最近的进展凸显了它在环境毒性、蛋白质组学和免疫学方面的潜力。该观点侧重于利用蛋白冠来提高血浆蛋白质组分析的深度，解决血浆中蛋白质浓度的高动态范围带来的挑战。蛋白冠简化了样品制备，富集了低丰度蛋白质，并提高了蛋白质组覆盖率。创新包括使用不同的纳米颗粒和加标小分子来增加定量蛋白质的数量。核心设施的可重复性问题需要标准化的方案。此外，自上而下的蛋白质组学可实现蛋白质形式特异性测量，从而更深入地了解蛋白冠的组成。未来的研究应旨在改进自上而下的蛋白质组学技术，并将蛋白冠研究和蛋白质组学相结合，以实现个性化医疗和高级诊断。

1 引言
蛋白冠是一层生物分子，主要是蛋白质，当纳米颗粒进入生物环境时，会在纳米颗粒周围形成 。该层可以决定纳米颗粒与给定生物系统的各种成分（包括免疫细胞）的相互作用，并决定纳米颗粒的药代动力学和生物命运。
 
对蛋白冠的初步研究主要集中在它给纳米医学和纳米毒理学带来的挑战 。例如，在静态体外细胞培养环境中形成蛋白冠会耗尽培养基中必需的营养物质和蛋白质，从而导致对细胞的间接毒性 。这种消耗可能导致纳米毒理学研究的错误结果，因为观察到的效果可能是由于培养基成分的消耗，而不是纳米颗粒本身的内在毒性。在纳米医学领域，人们寄予厚望，认为纳米粒子可以用表面靶向物种（如适配体和抗体）进行工程改造，以定位人体中的特定细胞并与之相互作用。这种靶向递送旨在将治疗分子（如药物）直接运输到患病细胞（如癌细胞），从而最大限度地提高疗效并最大限度地减少副作用。然而，在实践中，在纳米颗粒表面形成的蛋白冠通常会屏蔽这些靶向物种，导致误靶向和治疗效果降低。这种意外的掩蔽效应会损害治疗的精确递送，并降低基于纳米颗粒的治疗的整体效果。

蛋白冠领域的最新研究为解决各个领域的挑战开辟了新的机会，包括纳米颗粒的环境毒性、蛋白质组学和免疫学。例如，对环境中发现的纳米颗粒进行蛋白冠分析可用于追踪其途径，为风险管理和政策制定提供重要信息，以确保纳米颗粒的安全使用，并最大限度地减少其意外释放到环境和食物链中。在蛋白质组学中，纳米颗粒现在被用来降低血浆蛋白的复杂性，从而提高蛋白质组覆盖率并实现生物标志物的发现。此外，操纵蛋白冠可用于调节免疫反应，为开发免疫治疗剂来治疗免疫系统疾病开辟了新的途径 。在这些新兴应用中，本观点侧重于蛋白冠在蛋白质组学领域的使用。利用蛋白冠可以对血浆蛋白进行更深入的分析，促进生物标志物的识别和定量，并最终为开发潜在的诊断和治疗策略开辟可能性。

2 血浆蛋白质组分析的挑战
血浆蛋白质组分析的主要挑战是血浆中蛋白质浓度的高动态范围。血浆中含有大量蛋白质，浓度跨越 12 个数量级，从高丰度蛋白质（如白蛋白和免疫球蛋白）到低丰度蛋白质（如细胞因子）。如此广泛的范围阻碍了低丰度蛋白质的检测和定量，而低丰度蛋白质通常对诊断和治疗目的具有重要意义。基于质谱 （MS） 的蛋白质组学是血浆蛋白质组学分析的主要方法，可以在大约 4-6 个数量级的浓度动态范围内检测蛋白质，具体取决于所使用的仪器、样品制备工作流程、色谱和富集技术。

为了应对这一挑战，通常采用各种技术，如样品分离、高丰度蛋白质的去除和低丰度蛋白质的富集，以增强血浆蛋白质组的覆盖率。 在这一领域中，使用蛋白冠是一种新兴的方法，具有降低血浆蛋白复杂性的巨大潜力，因此增加了血浆中低丰度和稀有蛋白质的鉴定和定量的机会。

3 蛋白 CORONA 如何扩增血浆蛋白质组分析
3.1 到目前为止，我们知道什么？
蛋白冠可以通过选择性地将蛋白质吸附到纳米颗粒（http://www.purimagbead.com/Product/8096211554.html）表面来降低血浆的复杂性（图 1）。这种选择性吸附主要通过消耗高丰度蛋白质和富集低丰度蛋白质来提供帮助，从而降低血浆中蛋白质浓度的高动态范围。这允许检测和定量低浓度的蛋白质。此外，蛋白冠形成可以通过简化血浆样品的分级分离和纯化步骤来简化样品制备，从而提高工作流程的效率并获得更可重现的结果。


图 1

演示蛋白冠如何简化血浆蛋白质组分析的方案。由于血浆中存在高度丰富的蛋白质（如白蛋白、血清转铁蛋白和结合珠蛋白）以及血浆中存在的不同蛋白质形式，因此对血浆蛋白质组进行基于质谱的蛋白质组学分析具有挑战性。NPs 可以通过在其冠状体中吸附血浆蛋白的特定子集及其蛋白质形式来降低蛋白质组动态范围。此外，小分子，尤其是磷脂酰胆碱，可以大大提高吸附蛋白质的多样性，增强血浆蛋白质组覆盖率。磷脂酰胆碱和其他小分子可以结合白蛋白等高丰度蛋白，阻碍它们在 NP 蛋白冠的吸附。最终，通过自下而上或自上而下的蛋白质组学对血浆蛋白质组和蛋白质形式进行深度采样，可以发现各种疾病的生物标志物，从而了解患者和个人的整体健康谱。

蛋白冠的一个主要问题是附着在纳米颗粒表面的血浆蛋白数量有限，通常只有几百个[16]。为了提高定量血浆蛋白的数量，已经提出了利用一系列具有不同物理化学性质的纳米颗粒。不同类型的纳米颗粒对不同的蛋白质亚群具有不同的亲和力。通过使用一组具有不同物理化学性质的纳米颗粒，可以显著增加来自各种蛋白冠的定量血浆蛋白的数量，从而提供更全面的血浆蛋白质组分析。 然而，在此类方案中应用多种纳米颗粒会使样品制备过程更加劳动密集，并降低蛋白质组学分析的可重复性。

进一步提高蛋白冠中检测到的蛋白质数量的另一种策略是在小分子（如营养物质、维生素、脂质和代谢物）与纳米颗粒相互作用之前将其加标到血浆中。这些小分子可以与蛋白质相互作用，改变/阻断它们的结合位点，并在相同的纳米颗粒表面产生独特的蛋白冠。通过使用一系列小分子，可以在给定纳米颗粒的表面形成不同的蛋白冠。这种方法显著增加了已鉴定和定量蛋白质的数量，从而提高了使用单个纳米颗粒的血浆蛋白质组分析的深度。在测试的各种小分子中，在纳米颗粒蛋白冠形成之前在血浆中加标磷脂酰胆碱显着增加了检测到的蛋白质的数量。使用数据非依赖型采集方法，单次 LC-MS 分析可以定量单个血浆样品中多达 1436 种血浆蛋白，而单独血浆中可定量 322 种蛋白质。磷脂酰胆碱的这种独特能力归因于最丰富的血浆蛋白（包括白蛋白、血清转铁蛋白和结合珠蛋白）的选择性消耗。磷脂酰胆碱与此类蛋白质结合，阻碍它们与纳米颗粒表面的结合。磷脂酰胆碱同时消耗高丰度蛋白质可以减小血浆蛋白质组的动态范围，并能够定量丰度较低的蛋白质。

除了增加定量蛋白质的数量外，这种方法还可以选择性地分析血浆蛋白质组的各种亚群，从而降低整体复杂性并专注于特定的蛋白质组。例如，向血浆中添加胆固醇可以增强载脂蛋白与纳米颗粒表面的结合。这种靶向富集允许对特定蛋白质家族进行更详细的分析，从而有助于在给定的疾病环境中发现生物标志物。

3.2 我们如何利用蛋白电晕进一步提高蛋白冠分析的深度？
纳米医学界可以通过采用各种创新策略来显著提高蛋白冠分析的蛋白质组学能力，这些策略应在未来的研究中得到验证和探索。到目前为止，只有有限范围的小分子被应用于人血浆，以利用蛋白冠提高蛋白质组覆盖率。通过扩展这种方法，研究人员可以探索不同类型的生物分子，甚至设计特定的新分子，这些分子可以有效中和高丰度蛋白质与纳米颗粒表面的相互作用。这种策略可能导致鉴定有影响力的（生物）分子，这些分子能够进一步降低高丰度蛋白质在纳米颗粒表面的优势，从而允许吸附低丰度蛋白质。反过来，这将提高纳米医学应用中蛋白质组分析的深度。

4 核心设施之间的数据可重复性
4.1 到目前为止我们知道什么？
血浆蛋白质组学和蛋白冠研究的主要挑战之一是不同核心设施之间缺乏可重复性。为了在蛋白冠领域解决这个问题，至关重要的是要吸取数十年工作的经验教训，开发可靠的样品制备方案和统一的报告系统。这些策略包括涵盖从蛋白冠制备到其详细表征的整个过程的方案。然而，基于质谱的蛋白质组学对均匀包被纳米颗粒结果的具体影响尚未得到彻底研究。为了强调可重复性问题的严重性，我们最近进行了一项调查，将相同的蛋白冠包被样品送到 17 个不同的蛋白质组学核心设施进行分析。虽然不同核心一致检测到的蛋白质子集相关性良好，但它们只占总定量蛋白质的一小部分 （1.8%）（即 4022 种中的 73 种）。不同设施的蛋白质组深度不同，这给不同研究内部和之间的蛋白质和生物标志物检测带来了偏差。此外，这种不一致性在比较独立研究的结果方面构成了重大障碍，并突出了标准化方案和方法的必要性，以提高该领域的蛋白质组覆盖率和可重复性。

为了解决这个可重复性问题，我们提出了两种不同的方法。

第一种方法侧重于使用具有一致参数的统一方法对原始数据分析进行标准化，包括可变修饰、酶特异性、允许的漏诊切割次数和错误发现率阈值。通过实施这种协调分析方法，我们显著提高了蛋白质组学数据的连贯性，提高了重现性，并将不同核心设施中一致鉴定的独特蛋白质的百分比从 1.8% 提高到 35.3%。

第二种方法侧重于协调样品制备的工作流程。我们在内部制备肽，然后分析来自不同核心设施的相同肽消化物的 MS 数据。根据我们的初步研究结果，我们选择了性能最佳的 Core 进行肽分析。我们还研究了使用类似仪器和标准化数据库搜索参数和数据处理工作流程的影响。结果表明，随着每个标准化步骤的实施，各种蛋白质组学设施的数据一致性显著、逐步提高。

4.2 我们如何进一步应对可重复性挑战？
科学界在蛋白冠结果可重复性方面的进展凸显了蛋白质电晕分析中标准化程序的迫切需求，以提高研究之间的数据可靠性和可比性。鉴于不同实验室的不同能力和资源，以及质谱和蛋白质组学领域的不断发展，它们还引起了人们对实施这些标准的潜在挑战的关注。展望未来，建立蛋白冠分析的通用方案对于推进纳米医学至关重要。为了实现这一目标，蛋白冠纳米医学和蛋白质组学界应与标准化机构密切合作，为的质谱分析制准定标化方案。通过采用这些标准策略，我们可以提高蛋白冠研究的一致性和可靠性，确保结果在关重要。为了实现这一目标，不同研究和实验室之间具有可重复性和可比性。纳米医学和蛋白质组学界应与标准化机构密切合作，为

5 蛋白冠的蛋白质形式特异性测量
5.1 到目前为止，我们知道什么？
所有已发表的蛋白冠蛋白质组学研究都采用了广泛使用的自下而上的方法，该方法通过测量蛋白质酶消化产生的肽来识别和定量蛋白质。自下而上的蛋白质组学方法高度敏感且相对成熟，可以有效地用于测量蛋白质的各种属性，如丰度、稳定性/溶解度、氧化还原状态和翻译后修饰 （PTM）。然而，自下而上的蛋白质组学并不适合研究完整的蛋白质形式（图2）。蛋白形式，顾名思义，是源自同一基因的蛋白质的不同形式，在序列（例如截短或切割）、亚型（例如剪接）和 PTM 的累积存在方面存在变化。

图 2
显示自下而上和自上而下的蛋白质组学之间用于表征蛋白质冠状病毒蛋白质形态景观的差异的方案。一种蛋白 a 位于蛋白冠中，具有四种蛋白形式。蛋白形式 （Pr1） 有一个乙酰化 （Ac） 位点;Pr2 具有一个 Ac 和一个磷酸化 （P） 位点;Pr3 有两个 P 位点;Pr4 没有任何 PTM。当使用自下而上的方法分析样品时，由于样品制备过程中的样品损失或电喷雾电离过程中的电离效率低（例如磷酸化肽），无法识别酶处理产生的一些肽。此外，蛋白质中的某些区域不适合使用常用的蛋白酶消化。最后，自下而上的蛋白质组学通过部分 PTM 信息鉴定蛋白质组 a。无法弄清楚蛋白冠样品中的蛋白质形式，因为多种蛋白质形式组合可以产生相同的肽库，并且该方法无法识别所有肽和 PTM 信息。对于自上而下的蛋白质组学，在 MS 和 MS/MS 之前通过液相色谱或毛细管电泳分离完整的蛋白质形式。四种不同的蛋白质形式可以通过它们的不同质量来检测和区分。蛋白质形式之间的质量变化为当前的 PTM 提供了信息。自上而下的蛋白质组学能够提供蛋白质冠的蛋白质形式景观。

已经充分证明，来自同一基因的蛋白质形式可以具有不同的生物学功能。例如，一项对选择性剪接引起的蛋白质形式的整体功能研究表明，其中许多蛋白质形式在功能上表现为来自不同基因的不同蛋白质，而不是彼此的微小变异。以蛋白质形式特异性方式表征蛋白冠对于改善从人血浆中发现蛋白质生物标志物并开发更有效的纳米药物至关重要。

最近，我们开创了一种有效且稳定的基于 MS 的自上而下的蛋白质组学工作流程，用于测量聚苯乙烯纳米颗粒与健康人血浆样品孵育后蛋白冠中的蛋白质形式。基于 MS 的自上而下的蛋白质组学使用 MS 和串联 MS （MS/MS）直接测量完整蛋白质，是揭示蛋白冠蛋白质形态的理想选择（图 2）。我们的工作流程包括：与人血浆样品孵育后，使用去污剂溶液（即十二烷基硫酸钠，SDS）从纳米颗粒中洗脱蛋白冠，通过缓冲液交换进行蛋白质纯化，以及毛细管区间电泳 （CZE）-MS [33， 34] 和 MS/MS 分析。我们的方法已成功在聚苯乙烯纳米颗粒的蛋白冠中鉴定出数百种质量范围为 3-70 kDa 的蛋白质形式。我们揭示了 20 多种蛋白质生物标志物的多种蛋白质形式，以及 PTM 、信号肽切割和/或截断的组合。这种分析不适合自下而上的蛋白质组学分析，其中信息通常总结为包含多种可能蛋白质的“蛋白质组”（图 2）。这些数据突出了自上而下的蛋白质组学可以为蛋白质冠的表征增加的价值。展望未来，需要做出更多努力，从自上而下的测量来提高蛋白质组覆盖率和蛋白质形式表征的质量，尤其是大型蛋白质形式。更先进的自上而下的蛋白质组学技术具有更好的蛋白质组学样品制备、分离、MS 检测、气相碎裂以及生物信息学鉴定和定量是核心。另一方面，从大量疾病相关人类血浆样本中自上而下地测量蛋白冠，尤其是与一系列纳米颗粒结合，是发现疾病特异性蛋白质形式生物标志物的下一个关键步骤。

5.2 自上而下的蛋白质组学如何增强我们对蛋白冠的理解？
总体而言，自上而下的蛋白质组学不如自下而上的方法发达，特别是在蛋白冠研究的背景下。尽管其意义重大，但只有少数研究探讨了蛋白冠的自上而下的蛋白质组学。这种方法使纳米医学界能够更深入地了解蛋白冠的功能及其在疾病检测中的作用。自上而下的蛋白质组学特别有价值，因为它提供了有关蛋白质形式的详细信息，可以揭示疾病发生和进展的潜在机制。

未来的研究应侧重于利用自上而下的蛋白质组学的独特能力来更好地定义纳米颗粒的生物命运。由于蛋白质形式提供了对蛋白质功能和结构的更精确见解，因此这种方法可以帮助预测生物系统（包括免疫细胞）将如何响应纳米颗粒。为了全面了解蛋白冠在诊断和治疗中的应用，我们建议未来的研究旨在提高蛋白质形式表征的覆盖率和质量。为了提高蛋白冠的蛋白质形态覆盖率，必须付出更多努力来推进样品制备（即从纳米颗粒中洗脱蛋白冠并在自上而下的蛋白质组学测量之前进行净化）、蛋白质形态分离的峰容量和 MS 检测的灵敏度。例如，应探索新技术，例如溶解核心纳米颗粒，以允许在纳米颗粒表面完全恢复完整的蛋白质形式。此外，可以探索天然 CZE-MS 以更好地测量大蛋白质形式。为了提高蛋白质形式表征的质量，我们需要通过研究不同的片段化技术并整合自上而下和自下而上的蛋白质组学数据来提高蛋白质形式片段化的覆盖率。 PTM 自下而上的蛋白质组学提供的丰富信息对于更准确地解释自上而下的蛋白质组学的蛋白质形态水平数据非常有用。还需要特别注意使用自上而下的蛋白质组学进行蛋白冠研究的可重复性。必须应用从自下而上的蛋白质组学中吸取的经验教训，并将其应用于自上而下的方法。

应该在开发新的策略/方法上做出更多努力，以从纳米颗粒表面完全去除所有蛋白质以进行自上而下的蛋白质组学分析。目前，由于纳米生物界面处的复杂作用力，几乎不可能实现从纳米颗粒表面完全去除蛋白质以进行全面表征。然而，药物递送领域的经验提供了潜在的解决方案。在药物递送中，聚合物载体通常使用对蛋白质中性的特异性溶液去除或消化，从而能够收集和分析释放的蛋白质。基于这一概念，制备用于更安全、更有效治疗应用的个性化纳米颗粒的最新进展表明，可以消化蛋白冠涂层的金纳米颗粒的金核，留下柔软的蛋白质纳米壳。这种方法可以适用于蛋白质电晕的完整蛋白质组学分析。然而，必须为每种类型的纳米颗粒开发量身定制的方案，以有效地消化核心材料，同时保持蛋白质外壳的完整性。这将允许对蛋白冠进行更完整和准确的分析，从而增强我们对其组成和潜在治疗应用的理解。值得一提的是PuriMag公司开发的蛋白冠前处理磁珠（http://www.purimagbead.com/Product/8096211554.html），具有丰富的表面特性，可以针对不同蛋白亚群的低丰度蛋白形成富集，未蛋白组学前处理研究提供了无限可能。


6 展望
蛋白冠是纳米医学和蛋白质组学交叉的关键因素，通过选择性结合蛋白质提供显著的好处。这个过程耗尽了高丰度蛋白质，从而富集了低丰度蛋白质，并促进了蛋白质组学发现生物标志物所必需的蛋白质的分析。尽管有这些好处，但蛋白冠的研究仍处于早期阶段，仍然存在许多挑战。这些研究包括了解蛋白质-纳米颗粒相互作用的动力学和热力学，预测在小分子和不同生物环境存在下蛋白冠的组成，并将这些发现转化为临床应用。由于杂质会在蛋白质组学数据中引入错误，因此该领域的另一个挑战是开发和采用稳健的策略来确保蛋白冠保持不含蛋白质杂质 。各种类型的杂质及其处理策略已在文献中进行了广泛讨论。

蛋白冠研究最有前途的进展之一是自上而下的蛋白质组学的整合。与更成熟的自下而上的方法不同，自上而下的蛋白质组学允许直接分析完整的蛋白质形式——蛋白质的特异性变体，可以为疾病机制和纳米颗粒-细胞相互作用提供重要的见解。我们预计，随着自上而下的蛋白质组学技术的进一步发展，以更好地覆盖和表征蛋白质形式，蛋白冠的蛋白质形式特异性测量将彻底改变我们对生物系统中纳米颗粒行为的理解，并为从人血浆中发现新的蛋白质形式生物标志物打开大门。

为了进一步提高蛋白冠在蛋白质组学应用中的能力，研究人员应该探索超越当前方法的创新策略。这包括开发新型生物分子或小分子，这些生物分子或小分子可以选择性地调节蛋白质在纳米颗粒表面的吸附，从而提高对低丰度蛋白质的检测。此外，从纳米颗粒表面完全去除蛋白质的新方法可以使用自上而下的蛋白质组学对蛋白冠进行更彻底的分析，从而更深入地了解其组成和功能。另一个有前途的途径是探索个性化纳米颗粒，它可以根据特定的生物环境或疾病状态进行定制。通过定制纳米颗粒核心和表面特性，研究人员可以创建蛋白冠，这些蛋白冠针对特定疾病指定的独特蛋白质子集的检测进行了优化。

蛋白质组学分析、计算建模和机器学习算法的进步对于应对这些挑战至关重要。这些工具可以帮助破译蛋白质和纳米颗粒之间的复杂相互作用，从而在临床环境中实现更准确的预测和定制应用。

最近在蛋白冠领域引入的实际因果关系（即特定事件或条件之间的精确因果关系）的概念将提供更精确的理解影响蛋白质电晕组成的因素。这些因素包括纳米颗粒的物理化学性质，例如大小、形状和电荷、等离子体来源和生物环境。

扩大实际因果关系在蛋白质电晕研究中的应用可以促进高通量预测能力的发展，从而允许为特定应用量身定制的纳米颗粒的精确设计。这种方法可以显着提高基于纳米颗粒的诊断和治疗在不同疾病环境中的有效性和特异性。

随着对蛋白冠的理解加深，它与个性化医学和高级诊断的整合变得越来越可行。通过利用自上而下的蛋白质组学提供的独特蛋白质组学图谱，研究人员可以为个体患者开发更精确的诊断工具和治疗策略。这种方法可以识别新的生物标志物并开发更有效且副作用更少的靶向治疗方法。

总之，蛋白冠研究的未来在于蛋白质组学技术的持续进步、方法的标准化以及突破当前知识界限的创新策略的探索。通过解决这些关键领域，科学界可以释放蛋白质冠蛋白质组学的全部潜力，为纳米医学、疾病检测和个性化医疗保健的突破性发现铺平道路。

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