使用MagStart-NTA-Ni和MagStart-NH2固定化酶实例：

采用MagStart-NTA-Ni和MagStart-NH2类似磁珠固定化尿嘧啶磷酸核糖基转移酶（uracil phosphoribosyltransferase）制造嘧啶核苷-5′-单磷酸类似物（pyrimidine nucleoside-5′-monophosphate analogues）

• 将转移酶固定在戊二醛活化和NTA磁性微球上。

• 为可溶性和固定化转移酶建立了最佳操作条件。

• 转移酶固定在MagStart-NTA微球上导致最高的活性衍生物。

• 固定在戊二醛修饰载体上会产生最稳定和可重复使用的衍生物。

• NMPs的酶促合成是在短反应时间内进行的。


核苷酸的酶促合成是化学方法的一种有效且可持续的化学法替代方案。突变尿嘧啶磷酸核糖基转移酶TgUPRT2被选为最佳候选（69.5 IU/mg−1，UMP合成），亲和固定到MagStart-NTA-Ni上和戊二醛活化MagStart-NH2上。MagStart-NTA-Ni上（6127 IU / g；92%的保留活动，在 50–60 °C 下稳定性提高 3–5 倍）和戊二醛活化MagStart-NH2上（3711 IU / g；27%的保留活动；在50-60°C下稳定性提高8-20倍），显示出最佳的可操作性。此外，重复利用7-10次仍保留70%以上酶活。


酶固定化方法
酶固定化前使用http://biophysics.cs.vt.edu/估算酶的等电点和模拟表面质子化情况，以判断是N末端共价固定化还是赖氨酸残基的ε-NH2的固定化。

一方面，His标记的TgUPRT2固定在MagStart-NTA-Ni磁珠上。为此，将20μL磁珠悬液（25mg/mL）用200μL结合缓冲液（80 mM sodium phosphate, pH 8.0, 40 mM imidazole, 1.0 M NaCl）在室温下平衡20分钟。随后，20-60μg纯His标记的TgUPRT2 与MagStart-NTA-Ni磁珠混合。将悬浮液在室温下孵育10-15分钟。结合后，用洗涤缓冲液（80 mM sodium phosphate buffer, pH 8.0, 1.0 M NaCl）洗涤，所得固定化酶 (MNiUPRT21-3)在4°C下储存。

另一方面，TgUPRT2共价固定在戊二醛活化的MagStart-NH2磁珠上：i） 在 pH 7.5 下进行酶固定化，以促进酶的 N 端与磁珠作用 （MGlUPRT2N） 和 ii） pH 值为 10.5下的酶固定化，以通过去质子化的赖氨酸残基的ε-NH2进行固定化（MGlUPRT2Lys）。为此，将25μL磁珠悬液（20mg/mL）洗涤，然后在不同的结合缓冲液（50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.5, or 50 mM sodium borate buffer, pH 10.5）中平衡20分钟，随后在室温下用戊二醛活化4小时。之后，从溶液中磁性捕获珠子并冲洗以除去未反应的戊二醛分子。之后，100μg纯TgUPRT2 与戊二醛活化的微球混合，并将所得混合物在室温下振荡下孵育20小时。然后磁收集微珠，用结合缓冲液冲洗三次，并在3M甘氨酸存在下室温孵育3小时以阻断任何残留的戊二醛残留物。最后，用50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.5）洗涤磁珠，然后用所得生物催化剂（MGlUPRT2N 和 MGlUPRT2Lys）储存在4°C。

结果
MagStart-NTA-Ni磁珠固定化，酶活回收92%。
N末端共价固定在戊二醛活化的MagStart-NH2磁珠上，酶活下降72%。原因是N末端靠近酶活性中心。
赖氨酸残基的ε-NH2固定在戊二醛活化的MagStart-NH2磁珠上，酶活下降90%。原因是ε-NH2靠近酶活性中心。
固定化酶热稳定性提高，重复使用7-10次，酶活保留70%以上。

参考文献：
1. Javier Acosta, Kim Nguyen, Robert C. Spitale, Jesús Fernández-Lucas, Taylor-made production of pyrimidine nucleoside-5′-monophosphate analogues by highly stabilized mutant uracil phosphoribosyltransferase from Toxoplasma gondii, Bioresource Technology, Volume 339, 2021, 125649, ISSN 0960-8524,
https://doi.org/10.1016/j.biortech.2021.125649.
2. Jon del Arco, Javier Galindo, Vicente Javier Clemente-Suárez, Amaira Corrales, Jesús Fernández-Lucas, Sustainable synthesis of uridine-5′-monophosphate analogues by immobilized uracil phosphoribosyltransferase from Thermus thermophilus, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics, Volume 1868, Issue 1, 2020, 140251, ISSN 1570-9639, https://doi.org/10.1016/j.bbapap.2019.07.004.