一、免疫化学发展历史

       免疫学的发展史起始于微生物学研究，于18世纪建立，19 世纪至 20 世纪中期进入经典发展期。这一时期，人们对免疫功能的认识由人体现象的观察进入了科学实验时期。20世纪初期到中期，进入近代免疫学时期。从20世纪中期开始，真正进入现代免疫学时期。现代免疫学的检测基本历经了以下几个过程，如图1所示。

       免疫学检测主要是利用抗原和抗体的特异性反应进行检测，利用同位素、酶、化学发光物质等对检测信号进行放大和显示，常被用于检测蛋白质、激素等微量物质。各类免疫学检测方法的性质及发展状况详见表格1。免疫诊断在临床诊断中占据着非常重要的地位，但是从我国临床免疫诊断现状来看，其步伐都落后于发达国家，亟待改进。

表1. 各类免疫检测技术的性质及优缺点

	放射性免疫	酶联免疫	化学发光	电化学发光	纳米磁微粒化学发光
检测灵敏度	10-15	10-13	10-15- 10-18	10-17	10-21
精密度（批间差）	＞15%	10%-15%	＜10%-15%	5%	＜10%
线性范围	105	102	106-7	107	107
检测时间	3-4小时	2-3小时	65分钟	10分钟	18-40分钟
放射污染	有	无	无	无	无
操作	手工	手工/批量自动化	手工/全自动	全自动	全自动
有效期	2个月	6-12个月	12个月	12个月	12个月
定性/定量	定量	定性/半定量	定量	定量	定量
发展趋势	环境污染，国内处于衰退期；欧美已经完全淘汰。	国内处于成熟期；欧美处于衰退期。	国内处于导入期和成长期；欧美处于成熟期。	可使用项目广泛，罗氏专利技术。	各项目可随机组合使用，国内处于发展期。

       化学发光技术是近二、三十年来发展起来的一种测定方式。该技术的原理是利用化学反应释放的自由能激发中间体（常用碱性磷酸酶-金刚烷胺、辣根过氧化酶-鲁米诺衍生物、辣根过氧化酶-鲁米诺衍生物），使其从激发态回到基态。当中间体从激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而进行定量分析（见下图）。化学发光具有荧光的特异性，同时不需要激发光，避免了荧光分析中激发光杂散光的影响从而提高了灵敏度，并且避免了放射分析造成的环境污染和健康危害，是一种非常优秀的定量分析方法。

二、化学发光免疫分析的特点及发展动向

       化学发光免疫分析（CLIA）是一种高度敏感的微量测定技术，凡具有抗原性的物质（包括半抗原）都可以用CLIA测定。CLIA起步于80年代初，快速发展于90年代具备以下特点 ：
①高度敏感，极限达10^-17－10^-19mol/L，远高于放射性免疫（RIA）、酶联免疫（EIA）。与时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)相当，但比TRFIA便宜。
②特异性强，重复性好CV＜10％。
③测定范围宽，可达7个数量级。
④试剂稳定性好，无污染有效期12月。
⑤操作简单，易于自动化。
       磁微粒化学发光免疫分析是将磁性分离技术、化学发光技术、免疫分析技术三者结合起来的一种新兴分析方法，其基本原理见图3 。该技术充分利用了磁性分离技术的快速易自动化性，化学发光技术的高灵敏度性，以及免疫分析的特异性，在生物分析领域展现了不可替代的作用。

磁微粒化学发光免疫检测（双抗夹心法）原理示意图

       为进一步提高化学发光的检测灵敏度，采用纳米粒固定化酶标抗体，可以提高单个抗原表面结合的酶标抗体量，从而起到信号放大的作用，如下图：

       目前磁微粒化学分析免疫分析已经应用于管式化学发光免疫检测项目以及电化学发光免疫检测项目。管式化学发光作为目前发展最为迅速的化学发光检测仪器，受到普遍的关注，其基本原理如下图。

 磁微粒管式化学发光仪器远离图

三、用于免疫化学发光的磁性微球

       虽然目前用于化学发光的磁微粒种类繁多，但是其中最基本的要求就是磁响应快、单分散、粒径均匀、悬浮性好、非特异吸附低、稳定性好等，因此最常用的为磁性聚苯乙烯微球。目前全球磁微粒化学发光试剂主要为跨国公司垄断，其中Dyna、JSR、Merk、GE等的磁性微球占有较大市场份额。今年来国内亦涌现出一些磁性微球较为出色的公司，如PuriMag、海狸等。

能够用于化学发光免疫分析的磁珠种类

按材质分：

材质	优点	缺点
磁性琼脂糖微球	1. 亲水性强，温和的条件容易洗脱，不至于引起酶失活或蛋白质变性 2. 表面惰性，非特异性吸附低，受pH影响小 3. 容量大，具有开放性的支撑骨架 4. 组织相容性好	1. 机械性能和力学性能较差 2. 溶胀程度会随溶剂性质变化
磁性二氧化硅微球	1. 机械强度相对较强 2. 化学稳定性较优	1. 硅胶自身结构空隙较多，容易造成表面大量的水存积，增加了化学反应的复杂性 2. 碱性条件下非常不稳定 3. 存在较大的非特异性吸附性
磁性聚丙烯酰胺/聚丙烯酸类高分子微球	1. 具有较好的亲水性 2. 良好的血液相容性 3. 与其他高分子化合物共聚，改善其力学性能和稳定性	收缩过大，易产生缩孔
磁性聚苯乙烯微球	1. 机械强度高 2. 表面易功能化 3. 表面非离子相互作用弱 4. 交联聚苯乙烯能够在强酸强碱中保持稳定的结构 5. 微球粒径大小可控	聚苯乙烯微球表面为疏水性，对某些蛋白存在非特异性，需要对表面进行功能化修饰

按照官能团分：

磁珠种类	常见活化方法	配体的反应位点
羟基磁珠	CDI活化、溴化氰	氨基
羧基磁珠	EDC活化，NHS活化	氨基
氨基磁珠	戊二醛活化	氨基
环氧基磁珠	——	巯基、氨基
NHS磁珠	——	氨基
SA磁珠	配体生物素标记	生物素

 羧基、氨基和链霉亲和素磁珠是其中最常选用的表面功能化磁珠。

 四、免疫化学发光的基本原理

针对化学发光检测的不同原理，磁珠在化学发光领域的应用主要表面为一下几种形式：

方法一、 间接法

       间接法就是包被抗原，然后用酶标记的抗抗体检测样本中抗体，基本原理见下图，适合于检测对象是自身抗体的情况。间接法的优点：相对较方便，只要变换包被抗原就可以检测不同的项目。间接法的缺点：标本中的特异性抗体会竞争性的结合抗原，使结果出现假阴性。

采用间接法进行化学发光检测基本原理

操作步骤：

a)磁性微球表面固定抗原。
b)加入样本（含目标抗体）孵育，清洗。
c)加入酶标抗抗体孵育，清洗。
d)加发光底物，检测信号。

方法二、捕获法

       血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定，因此测定IgM抗体多用捕获法。基本原理如下图所示，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，去除IgG后测定特异性IgM。

采用捕获法进行化学发光检测基本原理

操作步骤：

a)将抗人IgM抗体连接在固相载体上形成固相抗人IgM，洗涤。
b)加入稀释的血清标本中的IgM抗体被固相抗体捕获洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。
c)加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合洗涤。
d)加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合洗涤。
e)加底物显色，检测信号。

方法三、固相抗原竞争法

       竞争法，是指受检抗体和酶标抗体竞争性的与磁珠表面抗原结合。固相抗原竞争法基本原理如下图所示。结合于固相载体的酶标抗体与受检抗体的量呈反比。若受检样本中无抗体，酶标抗体能够顺利与抗原结合，出现强信号。若受检样本中有抗体，则竞争性的占去了酶标抗体与抗原的结合，酶标抗体的结合力减弱，信号强度减弱。

采用固相抗原竞争法进行化学发光检测基本原理

操作步骤：

a)磁珠表面固定特异性抗原。
b)加受检标本和酶标抗原的混合液孵育。
c)加发光底物，检测信号。

方法四、双抗夹心（两步法）

       双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，基本原理如下图所示。

采用双抗夹心法（两步法）进行化学发光检测基本原理

操作步骤：

a)将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂。
b)加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时问，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。
c)加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量成正相关。
d)加发光底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。

方法五、双抗夹心法（一步法）

       在一步法测定中，应注意钩状效应（hook effect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果（如下图， 双抗夹心法及双位点一步法。缺点：假阴性）

采用双抗夹心法（一步法）进行化学发光检测基本原理

    采用双抗夹心法（一步法）进行化学发光检测，当样本中抗原量较多是，容易出现假阴性。

操作步骤：

a)磁珠表面固定一抗。
b)加样本和酶标二抗孵育，清洗。
c)加发光底物，检测信号。

五、发展展望

      磁微粒免疫化学发光因其特有的灵敏度，必将逐步替代现有的化学发光方法，成为抗原抗体免疫检测中的标准方法。因此，随着国内医院及检测机构的逐步更新换代，必将迎来10年左右的快速成长期。

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