普通交联剂

普通交联剂共十种：EDC、CMC、DCC、DIC、NHS、Slufo-NHS、MAL、NEM、SFB、丁二酸酐。

1. 碳二亚胺盐酸盐  EDC

图1 EDC分子结构

EDC和其他碳二亚胺是零长度交联剂。它们使羧酸（-COOH）与伯胺（-NH2）直接偶联，而不会成为靶标分子之间最终酰胺键交联的一部分。因为多肽和蛋白含有多个羧基和氨基，EDC直接介导的交联通常会造成多肽的随机聚合。EDC 首先与羧基发生反应，形成胺反应性 O-酰基异脲中间体，该中间体可与氨基快速反应形成酰胺键，释放异脲副产物。中间体在水性溶液中不稳定，因此两步偶联程序依赖于 N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 进行稳定。在存在 N-羟基磺基琥珀酰亚胺（磺基-NHS）的情况下，EDC 可用于将羧基转换为胺反应性磺基-NHS 酯。这是通过将 EDC 与含有羧基的分子混合并添加磺基-NHS 来实现的。如果不与胺发生反应，将导致中间体的水解、羧基的再生和 N-取代尿素的释放。副反应是形成 N-酰脲，通常仅限于位于蛋白疏水性区域的羧基。该交联剂已用于多种应用，如在肽合成中形成酰胺键、连接半抗原与载体蛋白形成免疫原、通过 5' 磷酸基标记核酸以及构建生物分子的胺反应性 NHS 酯。  

2. N-环己基-N′-(2-吗啉乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐  CMC

图 2 CMC分子结构

CMC是除EDC之外另外一种水溶性碳二亚胺试剂。用于羧基和氨基偶联形成酰胺键；在亲和色谱中用作偶联配体；可与巯基反应生成稳定的化合物。也用于 RNA 中假尿嘧啶残基的简单测序技术。  

3. N,N′-二环己基碳二亚胺  DCC

图 3 DCC分子结构

在肽合成中，DCC常被用来活化羧基，是一种很好的低温生化脱水剂，也用于酸、酐、醛、酮等的合成。不溶于水，在有机相反应居多。DCC可用于促进，7-(叔-丁基二甲基硅基)氧与丙酸的酯化反应生成7-(叔-丁基二甲基硅基)氧庚-2,4-二炔-1-醇。[3]还可用于合成：①通过2-苯乙烯基和2-(4-硝基苯基)异硫氰酸酯[2+2]环加成合成:1,3-噻唑烷衍生物。②1,3,5-恶二嗪-4-硫酮与苯甲酰异硫氰酸酯[4+2]环加成反应。③在芳香族(或异芳香族)羧酸存在下，通过与(N-异环氨基)三苯基磷烷反应，生成空间位阻的1,3,4-恶二唑衍生物。 

4. N,N′-二异丙基碳二亚胺  DIC

图 4 DIC分子结构

DIC是肽合成的偶联剂。替代肽合成中的二环己基碳二亚胺。水不溶性，常温下液体，比DCC更易分散均匀。  

5. N-羟基丁二酰亚胺  NHS

图 5 NHS分子结构

运用碳二亚胺方法，在改进的酰胺化以及肽偶联反应中的添加剂；用于在酰胺键形成时活化羰基基团。NHS 的特点：①NHS 的存在使 EDC 介导偶联的效率提高；②可使用任何含羧基的分子制备胺反应性 NHS 酯；③典型小分子（例如生物素）的 NHS 衍生物不带电荷、有机可溶（首先溶于 DMSO）且具有细胞膜可透过性；④高纯度结晶 NHS 可用于生成高质量活化衍生物。N-羟基丁二酰亚胺可用于合成氨基酸保护剂、半合成卡那霉素及医药中间体。  

6.N-羟基硫代琥珀酰亚胺 钠盐  Slufo-NHS

图 6 Slufo-NHS分子结构

Slufo-NHS是NHS的一种水溶性磺化类似物，用于蛋白的交联实验。Sulfo-NHS的特点：① Sulfo-NHS提高EDC介导的偶联效率；② 能够利用任何含羧基分子形成氨基反应性Sulfo-NHS酯；③ Sulfo-NHS衍生物通常直接溶于水（可直接加入生理缓冲液中），不可穿透细胞膜（可用于标记细胞表面）；④ 高纯度的晶体Sulfo-NHS可用于生成高品质活化衍生物。Sulfo-NHS能够控制和修饰碳二亚胺交联反应，包括活化羧酸根（—COOH）以偶联伯胺基（—NH2）。通过将Sulfo-NHS与一种含羧基分子及一种脱水试剂（如碳二亚胺EDC（EDAC））混合，可以方便地合成相关衍生物。该方法是制备许多类型蛋白标记试剂的基础，包括氨基反应性荧光染料、生物素亲和标签和聚乙二醇化化合物。  

7. 马来酰亚胺   MAL

图 7 MAL分子结构

马来酰亚胺(2，5-吡咯二酮) 是一种新型纳米颗粒表面官能团，易于与细胞穿透肽偶联；通过点击化学可实现偶联，同时保留其生物功能。马来酰亚胺用于，铑催化的芳基硼酸共轭芳基化反应。马来酰亚胺官能化二氧化硅颗粒可用于固定牛血清白蛋白（BSA）-硼酸（BA）偶联物。  

8. N -乙基马来酰亚胺    NEM

图 8 NEM分子结构

NEM用于共价修饰蛋白质的半胱氨酸残基的试剂，疏基烷化剂，使依赖于NADP的异柠檬酸脱氢酶和许多的内切酶失活。水溶液不稳定，水解速率为假一级，显著依赖于pH值。  

9. 对甲酰基苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯   SFB

图 9 SFB分子结构

SFB末端含醛基的氨基反应活性试剂，用于引入醛基，特别是杂交反应中碱性磷酸酶的醛基化。  

10. 丁二酸酐（二氢-2,5-呋喃二酮）

图 10 丁二酸酐分子结构

丁二酸酐易水解、胺化，用于固相氨基表面的共价修饰。丁二酸酐是丁二酸的五元环环酸酐。它被广泛应用于高分子材料、医药、农用化学品、染料、表面活性剂、有机阻燃材料的制造。它也可作为离子交换膜的交联剂和环氧树脂的固化剂。可用于制备：①共价交联的氧化藻酸盐/N-琥珀酰-壳聚糖水凝胶，作为组织工程的注射系统。②制备芯片上的功能化氧化物表面。③作为起始原料，以金属三氟酸盐作为催化剂合成聚酯。④作为交联剂提高玉米蛋白膜的力学性能和抗菌活性。

同型双功能交联剂

同型双功能交联剂在间隔臂两端具有相同的反应基团（图1）。通常，它们只能用于一步法反应过程中，以随机“固定”或聚合含有相似功能基团的分子。例如，将氨基-氨基交联剂添加到细胞裂解液中，将导致蛋白质亚基、相互作用蛋白质以及在溶液中其赖氨酸侧链恰好彼此邻近的任何其他多肽发生随机偶联。这是捕获所有蛋白质相互作用的“快照”的理想方法，但不能满足需要精确交联的应用需求。以氨基微球为例，我们可以选择两端同时含有醛基、NHS酯等具备氨基反应活性的交联剂，交联剂的一端可以与微球表面的氨基反应，另外一端则与抗体上的氨基反应(如图2)。但由于交联剂两端的官能团均可与微球表面的氨基反应，若条件不当，则容易因微球自身交联而产生聚集，为了避免该现象的发生，该反应需要添加大大过量的交联剂。

图1. 戊二醛分子结构 同型双功能交联剂示例

图 2   戊二醛法偶联氨基微球

这里介绍十种同型双功能交联剂，分别为：戊二醛、DSS、DSG、DMA、DMP、DMS、DTBP、DSP、DTSSP、Sulfo--EGS。  

1. 戊二醛

戊二醛（见图1）是一种常用的液体同型双功能交联剂。戊二醛易溶于水（混溶），商品化戊二醛通常为20%~70%水溶液。在已知醛中，戊二醛是一种最好的蛋白质交联剂，交联的特点是活性高，反应快，结合量高，产物稳定，对沸水、酸、酶的抵抗能力强。  

2. 辛二酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯) DSS

图 3  DSS分子结构

DSS是一种常用的简单交联剂，其在短间隔臂的两端具有相同的靶向氨基的NHS酯基团。包含8个原子的连接基（8个碳原子长链），间隔臂长度（11.4Å）是最终的偶联分子（即靶标氨基中的氮分子）之间的最大分子距离。DSS是一种膜可渗透的同型双功能交联剂。疏水性，使用前需先溶于有机溶剂。

3. 双琥珀酰亚胺戊二酸酯 DSG

图 4  DSG分子结构

DSG是一种氨基反应活性试剂，含5个碳原子长链；疏水性，使用前需先溶于有机溶剂。DSG 是一种可降解 (cleavable) 的 ADC 交联剂，用于合成可用于合成抗体偶联药物 (ADC)。  

4. 二甲基己二酸 DMA

图 5  DMA分子结构

DMA是一种用于蛋白质研究的交联剂。氨基反应活性试剂，含6个碳原子长链；水溶性，适用于交联、蛋白质相互作用和蛋白质修饰。该试剂在中性 PH 下易水解。  

5. 二甲基吡咪酯 DMP

图 6  DMP分子结构

DMP是一种同型双功能交联剂，适用于交联、蛋白相互作用和蛋白修饰。试剂在中性pH下易于水解。通常，在pH7.0-10.0的范围内，与伯胺反应形成脒键。氨基反应活性试剂，含7个碳原子长链；水溶性。  

6. 丙二酸二甲酯 DMS

图 7  DMS分子结构

DMS是氨基反应活性试剂，含8个碳原子长链；水溶性，适用于交联、蛋白质相互作用和蛋白质修饰。该试剂在中性 pH 下易水解。作为以下反应的反应物：①酪氨酸酶的化学修饰以进行偶联，从而产生生物催化酶流动检测器。②合成胶原-磷酸钙复合材料的交联剂。  

7. 3,3′-二硫代双丙亚氨酸二甲酯 二盐酸盐 DTBP

图 8  DTBP分子结构

DTBP是可硫醇裂解的同双功能胺反应性交联剂。氨基反应活性试剂，含8个碳原子长链；水溶性，适用于交联、蛋白质相互作用和蛋白质修饰。该试剂在中性PH 下易水解。在偶联反应时应避免使用还原剂，其中心二硫键可以被还原剂裂解。它包含一个胺反应性亚氨酸酯，亚氨酸酯在 pH 值 8-10 下与伯胺反应形成稳定的脒键。脒发生质子化，因此，与其修饰的赖氨酸一样，在生理 pH 值下具有正电荷。  

8. 二硫双(琥珀酰亚胺丙酸酯) DSP

图 9  DSP分子结构

DSP是水不溶性（首先溶于 DMF 或 DMSO）、同型双功能 N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS 酯）交联剂，具有硫醇可切割性、伯胺反应性，适用于多种应用。DSP 在8个碳原子间隔臂的每端有一个胺反应性 NHS 酯。NHS 酯在 pH 值 7–9 的条件下与伯胺反应可形成稳定的酰胺键，并释放 N-羟基琥珀酰亚胺。蛋白（包括抗体）通常在赖氨酸 (K) 残基的侧链和每个多肽的 N 端有若干伯胺，这些伯胺可用作 NHS 酯交联试剂的靶标。如果相关的应用需要一个在还原剂条件下不能裂解的稳定间隔臂，也可使用 DSP 交联剂的不可切割类似物 DSS。  

9. 3,3’-二硫双(磺基琥珀酰亚胺丙酸酯) DTSSP

图 10  DTSSP分子结构

DTSSP(Sulfo-DSP）是一种广泛采用的水溶性交联剂，其含有胺反应性 N-羟基磺基琥珀酰亚胺（磺基-NHS）酯，位于8碳间隔臂的各端。磺基-NHS 酯在 pH 7-9 条件下与伯胺反应可形成稳定的酰胺键，同时释放 N-羟基磺基琥珀酰亚胺离去基团。蛋白（包括抗体）通常在赖氨酸 (K) 残基的侧链中有若干伯胺和每个多肽的 N 端，这些多肽可用作 Sulfo-NHS 酯交联试剂的靶标。DTSSP间隔臂中的二硫键在pH 8.5条件下易于被10-50mM DTT或TCEP裂解，不可透过膜，允许细胞表面标记。DSS（DTSSP 的非磺化类似物）也可用于需要膜可透过性交联剂的应用。  

10. 乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺琥珀酸酯) Sulfo--EGS

图 11  Sulfo-EGS分子结构

Sulfo-EGS 是一种水溶性交联剂，含有位于 12 原子间隔臂周围的胺反应性 sulfo-NHS 酯末端，其可通过在 pH 值 8.5 时使用羟胺处理进行裂解。氨基反应活性试剂，水溶性，空间臂含有两个酯键，可在羟胺作用下裂解生成两个末端氨基的化合物，释放乙二醇。膜不渗透性，可进行细胞表面标记；在 pH 值为 8.5 时于 37°C 下使用羟胺处理持续 3 至 6 小时，形成的交联是可逆的。

上一篇文章介绍了什么是同型双功能交联剂，以及其中十种同型双功能交联剂：戊二醛、DSS、DSG、DMA、DMP、DMS、DTBP、DSP、DTSSP、Sulfo--EGS。本篇继续简单介绍一些常用的同型双功能交联剂的特性：BS(PEG)5、BS(PEG)9、碳酰肼、ADH、BMOE、Bis-Mal、DPDPB、Mal-PEG-Mal、CDI、DSC。  

1. 双-五聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯BS(PEG)5

BS(PEG)5是氨基反应活性试剂，通过柔性PEG间隔臂不可逆地交联蛋白质或肽；适合小分子或肽结合；具有确定的分子量和间隔臂长的均质化合物,提高交联精度。在 pH 7-9 下，NHS 酯与 -NH2 基反应形成稳定的酰胺键。PEG间隔臂提供独特的优势，包括增加稳定性、降低聚集倾向和降低免疫原性。BS(PEG)9与BS(PEG)5特性较为相似。  

2. 碳酰肼

碳酰肼水溶性佳，可与含醛或酮的分子反应生成腙。具有很强的还原性，无毒，可替代水合肼、肟类。通过缩合反应，与各种醛和配体合成多齿席夫碱配体。可用作锅炉水的除氧剂。可用作火箭推进剂的组分，彩色显影和肥皂质量的稳定剂，橡胶的抗氧剂，锅炉水除氧剂，以及金属的钝化剂等。还可以用作化纤行业作弹性纤维的交联剂。  

3. 己二酸二酰肼  ADH

己二酸二酰肼对醛类具有特异性，从而形成相对稳定的肼键；通常用于糖蛋白(如抗体)的连接，在高碘酸氧化后以特定的位点方式进行连接。在pH5.0条件下，由于肼的pKa较低，避免了伯胺的竞争，所以氧化和偶联可以顺利地进行。ADH是一种低分子量化合物，每个末端都包含一个酰肼基团。这可为重金属提供额外的吸附位点，从而维持或提高交联吸附剂的吸附能力。ADH可用作多个领域的交联剂，如制造机械乳胶膜和可注射氧化透明质酸水凝胶。  

4. 双马来酰亚胺乙烷 BMOE

BMOE 是一种马来酰亚胺交联剂，用于巯基基团（例如，蛋白或肽半胱氨酸）之间的不可逆共价偶联。短(8.0Å) 巯基-巯基交联剂，由马来酰亚胺基团和7-原子间隔臂组成；最短的双马来酰亚胺交联剂，可用于近距离交联。不溶于水，首先溶于 DMF 或 DMSO 中，然后添加至水性反应缓冲液。BMOE、BMB和BMH是同型双功能马来酰亚胺交联剂，可用于巯基（-SH）之间的缀合。此类双马来酰亚胺交联剂通常用于探索和表征蛋白质结构（即，寡聚化）或蛋白质相互作用。因为BMOE、BMB和BMH具有相同的反应性但长度不同，因此这三种试剂在蛋白质寡聚体中位点之间形成交联或相互作用的相对成功性可有助于确定分子内和分子间的距离。  

5. N,N′-(4,4′-亚甲基二苯基)双马来酰亚胺 Bis-Mal

Bis-Mal是一种同型双功能交联剂。用于固化桐酸缩水甘油酯（GEEA）。作为双马树脂基体，具有突出的特性：抗热性、抗氧化性、抗辐射性。广泛应用于电力、航空、航天、计算机、通讯、汽车、铁路、建筑等工业领域。  

6. N,N'-(丁烷-1,4-二基)双(3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酰胺) DPDPB

DPDPB是巯基-巯基交联剂，与两个含巯基基大分子反应后得到中间臂为14个原子的碳链，臂长约为16Å;水不溶性，使用前需先溶于有机溶剂。  

7. Mal-PEG-Mal

Mal-PEG-Mal是巯基-巯基交联剂，PEG间隔臂分子量为2000或5000，适用于交联蛋白质或肽；提高交联产物的水溶性及抗蛋白降解能力。活化的PEG衍生物可用于修饰肽、蛋白质或其它生物交联应用。聚乙二醇化的材料已经发现在药物输送系统，病毒学和免疫学中的广泛使用，作为PEG的掺入改善药理学特性，如增加水溶性，增强抗降解(蛋白质水解)，增加循环半衰期，并降低抗原性。除了聚乙二醇化，活化的PEG衍生物也可以用来形成用于组织工程或药物输送应用的网络，这取决于架构和反应性。  

8. 羰基二咪唑 CDI

CDI是羰基化试剂，可与带羰基或羰基的分子反应，生成氨基反应活性的中间体，是合成氨基甲酸酯类化合物的重要试剂。CDI是咪唑的衍生物,其咪唑结构中具有一个闭合的大P键,且其中一个氮原子未成键的sp2轨道上有一对孤对电子。这些决定了CDI具有较强的化学反应活性,能与氨、醇、酸等官能团反应,合成许多用一般化学方法难以得到的化合物。广泛用作酶和蛋白质粘合剂,抗生素类合成药物中间体,特别是作为合成多肽化合物的键合剂。  

9. N-琥珀酰氨基碳酸酯 DSC

图9 DSC分子结构

对亲核试剂有高反应活性，可与带氨基的分子反应生成尿素类似物，或在无水有机相活化带羧基的分子，生成氨基反应活性的中间体，用于建立羧基和氨基之间的连接，是合成氨基甲酸酯类化合物的重要试剂。

异型双功能交联剂

异型双功能交联剂的两端具有不同的反应基团（图1）。这些试剂不仅可以对具有各自靶标功能基团的分子进行单步法偶联，而且可以进行顺序（两步法）偶联，最大程度的减少不想要的聚合或自身偶联。在顺序偶联过程中，首先使用交联剂最不稳定的基团使异型双功能试剂与一种蛋白质反应。除去过量的未反应的交联剂后，将经修饰的第一种蛋白质加入到含有第二种蛋白质的溶液中，在该溶液中，通过交联剂的第二反应基团发生反应。最广泛使用的异型双功能交联剂在其一端具有与氨基反应的琥珀酰亚胺酯（NHS酯），另一端具有与巯基反应的活性基团（例如马来酰亚胺）。由于NHS酯基团在水溶液中较不稳定，所以它通常先与一种蛋白质反应。如果第二种蛋白质不具有可用的天然巯基，则可在偶连之前添加一步，使用巯基试剂为该蛋白添加巯基。

图1.异型双功能交联剂示例

Sulfo-SMCC是一种常用的交联剂，其在一端具有与氨基反应的Sulfo-NHS酯基团（左），在环己烷间隔臂的相对端具有与巯基反应的马来酰亚氨基团（右）。这使其可以用于两步法顺序偶联。这里介绍十种异型双功能交联剂，分别为：2-IT（Traut）、SMCC、LC-SMCC、SM(PEG)n 、碘乙酸-NHS酯、EMCS、Mal-（PEG）n-NHS Ester、MBS、SMPB、SMPH。  

1. 2-亚氨基硫烷盐酸盐  2-IT（Traut）

图 2  2-IT（Traut）分子结构

Traut试剂，蛋白质修饰试剂，通常用于将硫醇基团连接到蛋白质和肽上。Traut 试剂是一种用于硫醇化（巯基加成）的环状硫代亚氨酸酯化合物。Traut 试剂与伯胺 (—NH2) 反应，可在保持与原始氨基类似的电荷特性的同时引入巯基 (—SH)。一旦添加，就可针对各种有用的标记、交联和固定程序中的反应特定靶向巯基。用 2-IT 修饰的毛发角蛋白纤维的拉曼光谱分析。HCl 显示出新的二硫化物基团的形成在 pH 7-10 下，通过脒键反应，得到游离巯基。可用于制备二硫化物和/或硫醚连接的缀合物。注意：脒键具有初始伯胺的正电荷以保持蛋白溶解度。包含五个原子的连接臂，以降低空间位阻。  

2. 4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯 SMCC

图 3  SMCC分子结构

SMCC是一种异双功能交联剂，其包含一个具有胺和巯基反应性的延长间隔基。它通常首先通过酰胺键（pH7.5（7.0-9.0）缓冲）与含有伯胺的分子进行偶联。第二次偶联通过硫醚键（pH6.8（6.5-7.0）缓冲）与含有游离巯基的分子进行特异性偶联。SMCC包含九个原子连接子。与芳族间隔基相比，延伸的脂族间隔基可在偶联之前稳定马来酰亚胺。在水溶液中，NHS 酯水解降解是竞争反应，其速率随 pH 值的增加而提高。马来酰亚胺基团比 NHS-酯基团更稳定，但水解缓慢，且在 pH 值 > 7.5 时会失去对巯基的反应特异性。由于这些原因，通常在 pH 7.2–7.5 条件下使用这些交联剂进行偶联，与 NHS 酯（胺靶向）反应的时间在与马来酰亚胺（巯基靶向）反应之前或二者同时进行。可用于制备酶免疫结合物和半抗原载体分子结合物。水不溶性（可首先溶于 DMF 或 DMSO 中，或者选择水溶性的Sulfo-SMCC ）。  

3. 琥珀酰亚胺 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸) LC-SMCC

图 4  LC-SMCC分子结构

LC-SMCC是SMCC 的长链形式，是一种胺对巯基交联剂，含有 NHS 酯和马来酰亚胺反应性基团，位于长环己烷稳定间隔臂（16.2 埃，SMCC 8.3埃）的相对两端。LC-SMCC与SMCC应用较为一致。  

4. PEG化，长链SMCC交联剂  SM(PEG)n

图 5  SM(PEG)n 分子结构

SM(PEG)n   NHS-和马来酰亚胺活化的PEG化合物用于蛋白质和其他分子中的伯胺（NH 2）和巯基（SH）之间的交联。产品提供了一整套化合物，每种化合物具有相同的异双功能结构（NHS-PEGn-马来酰亚胺），但离散的乙二醇单元（n = 2,4,6,8,12或24）的数量不同。N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS）基团在pH 7-9下与赖氨酸和N-末端氨基能够发生有效的特异性反应，形成稳定的酰胺键。马来酰亚胺基团在pH 6.5-7.5下与还原型巯基反应，形成稳定的硫醚键。通过柔性PEG间隔臂不可逆地交联蛋白质或肽；聚乙二醇间隔臂有助于保持偶联物溶解度；具有确定结构和分子量的纯化合物，确保可重复的蛋白质修饰效果；PEG间隔臂提供独特的优势，包括增加稳定性、降低聚集倾向和降低免疫原性。  

5. 碘乙酸-NHS酯

图 6  碘乙酸-NHS酯分子结构

碘乙酸-NHS酯具有氨基和巯基反应性的双异官能团交联剂。典型情况下，最初通过 pH 7.5 (6.5-8.5) 缓冲条件下的酰胺键偶联到含有伯胺的分子上，接着通过 pH 7.5 (7.0-8.0) 缓冲条件下的硫醚链与含有自由巯基的分子进行特异性次级键合。用于制备酶免疫交联剂和半抗原载体分子偶联物。提供两个原子的连接基。碘乙酰基具有光敏性，使用时注意避光。  

6. 6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯 EMCS

图 7  EMCS分子结构

EMCS 是一种具有氨基和巯基反应性的双异官能团交联剂。含有 NHS 酯和马来酰亚胺反应性基团，位于中等长度间隔臂（9.4 埃）的相对两端。NHS 酯末端在 pH 值 7-9 条件下与伯胺偶联，形成稳定酰胺键；马来酰亚胺在 pH 值 6.5-7.5 条件下与 -SH 基团反应，形成稳定硫醚键；不溶于水（首先溶于 DMF 或 DMSO中，或者 选择水溶性的Sulfo-EMCS ）。EMCS 是一种制备半抗原结合物和酶免疫偶联物的独特而有用的试剂。含有马来酰亚胺侧链作为抗肿瘤剂的阿霉素葡糖苷酸前药的合成。  

7. 马来酰亚胺-(PEG)n-琥珀酰亚胺酯 Mal-(PEG)n-NHS Ester

图 8  Mal-(PEG)n-NHS Ester分子结构

Mal-PEGn-NHS Ester（n=2，6，8，12）是一种具有短环氧乙烷间隔基的异双功能交联剂，用于将胺基与含巯基化合物或生物分子的连接。马来酰亚胺官能团将与巯基反应，而琥珀酰亚胺酯基团将与胺反应。间隔基长度根据PEG数量不一样在 17.6埃~53.3埃间。  

8. 3-马来酰亚胺基苯甲酸 N -羟基琥珀酰亚胺酯 MBS

图 9  MBS分子结构

MBS 是一种对伯胺和巯基具有反应性的双异官能化交联剂。通常，初始反应在pH为7.0时，通过酰胺键偶联至含伯胺的分子，然后在相同pH通过硫醚偶联至含巯基的化合物。用于制备酶免疫交联剂和半抗原载体分子偶联物。MBS可用作固定剂，用于保持花粉管纤维状肌动蛋白的分布。它用于花粉管时产生的损伤较少。水不溶性（可首先溶于 DMF 或 DMSO 中，或者选择水溶性的Sulfo-MBS）说明：芳基马来酰亚胺比烷基马来酰亚胺连接基更不稳定。  

9. 琥珀酰亚胺基 4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯 SMPB

图 10  SMPB分子结构

SMPB 是一种胺对巯基交联剂，含有 NHS 酯和马来酰亚胺反应性基团（位于中等长度芳香族间隔臂（11.6 埃）的另一端）;MBS 的扩展链类似物;；不可裂解；不溶于水（首先溶于 DMF 或 DMSO，或者选择水溶性的Sulfo-SMPB）；与 SMPB 形成的偶联物在血清中比 SPDP 偶联物更稳定。  

10. 琥珀酰亚胺 6-((β-马来酰亚胺丙酰氨基)己酸) SMPH

图 11  SMPH分子结构

SMPH 是一种胺对巯基交联剂，含有 NHS 酯和马来酰亚胺反应性基团，位于长间隔臂（14.2 埃）的相对两端。与 SMPB 相比，碳链较长且溶解度较高；NHS 酯在 pH 值 7-9 条件下与伯胺反应，形成稳定的酰胺键；马来酰亚胺在 pH 值 6.5-7.5 条件下与 -SH 基团反应，形成稳定的硫醚键；不可裂解；不溶于水（首先溶于 DMF 或 DMSO）。

上一篇文章介绍了什么是异型双功能交联剂，以及其中十种异型双功能交联剂：2-IT（Traut）、SMCC、LC-SMCC、SM(PEG)n 、碘乙酸-NHS酯、EMCS、Mal-（PEG）n-NHS Ester、MBS、SMPB、SMPH。本篇继续简单介绍一些常用的异型双功能交联剂的特性：SPDP、LC-SPDP、GMBS、BMPS、Sulfo-KMUS、SMPT、SIAB、SATA、SAMSA。  

1. 3-（2-吡啶二硫）丙酸 N -羟基琥珀酰亚胺酯 SPDP

图 1  SPDP分子结构

SPDP是具有胺和巯基反应性的异型双功能交联剂。通常先在pH 7.5(6.5-8.5)的缓冲条件下通过酰胺键与含有伯胺的分子偶联。在pH 8.0(7.5-8.5)的缓冲条件下通过硫醇-二硫化物交换反应，与含有游离巯基的分子特异性二次偶联。此外，该试剂还可在初次偶联和还原接头后用作受保护的硫醇化试剂。通常用于氨基微球的硫醇化。SPDP不溶于水（首先溶于 DMF 或 DMSO）；SPDP中间臂链接PEG相比普通-CH2-具有更佳的水溶性；同时连接NHS-酯能更好的避免蛋白聚集。应用：蛋白的可逆交联；通过连接至赖氨酸残基向蛋白添加巯基；通过两步反应蛋白交联形成抗体-酶和其他生物偶联物；半抗原连接至载体蛋白用于抗体生产；制备免疫毒素偶联物。 

2. 琥珀酰亚胺 -6(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰氨基)已酸酯 LC-SPDP

图 2  LC-SPDP 分子结构

LC-SPDP 是一种长链异型双功能交联剂，可以通过 NHS 酯和吡啶基二硫基反应性基团与半胱氨酸巯基形成可切割（可还原）二硫键，实现胺与巯基的偶联。间隔臂中的二硫键在pH 8.5条件下易于被10-50mM DTT或TCEP裂解。SPDP 类试剂的胺反应部分是 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯。反应最通常在 pH 7-8 的磷酸盐、碳酸盐/碳酸氢盐或硼酸盐缓冲液中进行。可以使用其他不包含伯胺（或硫醇或二硫化物还原剂–参见巯基反应性的讨论）的缓冲剂。pH 值越高，反应和水解降解的速率越大；例如，NHS 酯的半衰期在 pH 值为 7 时为数小时，而在 pH 值为 9 时不到 10 分钟。SPDP 和 LC-SPDP 等 NHS 酯试剂的水溶性有限，在将其添加到反应混合物之前，必须先将其溶于有机溶剂中。诸如 Sulfo-LC-SPDP 的 Sulfo-NHS-酯试剂是水溶性的，可以直接添加到水性反应混合物中。  

3. 4-马来酰亚胺基丁酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯 GMBS

图 3  GMBS分子结构

GMBS一种具有胺和巯基反应性的异双功能交联剂。通常，最初通过在 pH 7.5 (6.5-8.5) 下缓冲的酰胺键与含有伯胺的分子偶联。通过硫醚键在 pH 6.8 (6.5-7.0) 下缓冲的含游离巯基的分子的特异性二次偶联。用于制备酶免疫结合物和半抗原载体分子结合物。不溶于水（首先溶于 DMF 或 DMSO，或者选择水溶性的Sulfo-GMBS）。脂肪族间隔系列的 C4 同系物包括 AMAS、BMPS、GMBS 和 EMCS。  

4. 3-（马来酰亚胺基）丙酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯 BMPS

图 4  BMPS分子结构

BMPS 是一种胺对巯基交联剂，含有 NHS 酯和马来酰亚胺反应性基团，位于短间隔臂 (5.9 Å) 的相对两端。用于诸如酶免疫测定前半抗原与酶交联或荧光底物与肽抗原交联等技术，用于荧光免疫测定。  

5. N-κ马来酰亚胺基十一烷氧基-磺基琥珀酰亚胺酯 Sulfo-KMUS

图 5  Sulfo-KMUS分子结构

Sulfo-KMUS 是一种水溶性胺对巯基交联剂，含有 NHS 酯和马来酰亚胺反应性基团，位于长间隔臂 (16.3 Å) 的相对两端。NHS酯在pH 7-9时与伯胺反应生成酰胺键，马来酰亚胺在pH6.5-7.5值下与巯基反应，形成稳定的硫醚键。在水溶液中，NHS酯的水解降解是一个竞争反应，其速率随pH值的增加而增加。马来酰亚胺组比NHS-酷组更稳定，但在pH值大于7.5时，会缓慢水解并失去其对巯基的反应特异性。由于这些原因，涉及这种类型的异双官能交联剂的共扼实验通常在pH7.2-7.5下进行，与NHS-酯(胺靶向)反应之前或与马来酰亚胺(巯基靶向) 反应同时完成。  

6. 4-琥珀酰亚胺氧羰基-α-甲基-α(2-吡啶基二硫基)甲苯 SMPT

图 6  SMPT分子结构

SMPT 是一种长链交联剂，可以通过 NHS 酯和吡啶基二硫基反应性基团与半胱氨酸巯基形成强（位阻）但可切割（可还原）二硫键，实现胺与巯基的偶联。SMPT常用于将毒素分子与针对细胞表面抗原的单克隆抗体偶联。SMPT产生的这些免疫毒素具有很强的杀伤力，因为与没有可切割键的结合物(如SPDP)相比，可切割的二硫键具有更大的细胞毒性。此外，在间隔臂中的吡啶-2-硫酮旁边是苯环和与阻碍二硫键的碳相邻的甲基，允许在体内特殊的共扼稳定性。SMPT具有比其他NHS交联剂在水溶液中更稳定的水解的额外好处。  

7. 琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯 SIAB

图 7  SIAB分子结构

SIAB 是一种中等长度 (10.6 Å) 的交联剂，可以通过 N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 酯和碘乙酰反应性基团实现胺与巯基的偶联。Sulfo-SIAB是以钠盐的形式存在的，水溶性约为10mM。SIAB必须首先溶解在有机溶剂中，如DMSO或DMF，然后添加到反应混合物中。SIAB是亲脂性的，膜渗透性的，不具有带电基团。  

8. N-琥珀酰亚胺 S-乙酰巯基乙酸酯 SATA）

图 8  SATA分子结构

SATA 是一种短链（2.8 Å）试剂，用于伯胺的共价修饰以及添加受保护但可暴露的巯基，能够实现异型双功能交联。在温和条件下可使硫醇去保护。通常在pH为7.5时引发耦合反应，通过酰胺键生成含伯胺的分子。在中性pH时可与0.05M羟胺发生去保护反应。用于制备酶免疫交联剂和半抗原载体分子偶联物。SATA中间臂链接PEG相比普通-CH2-具有更佳的水溶性；更好的避免蛋白聚集。  

9. S-乙酰巯基丁二酸酐 SAMSA

图 9  SAMSA分子结构

S-乙酰巯基丁二酸酐是一种胺反应性试剂，含有巯基。当被胺亲核试剂攻击时，酸酐区域打开，形成胺键。但是，在该开环反应过程中，形成了游离的羧酸根基团，使分子带负电。电荷逆转影响蛋白质的活性和分子的构象。