唾液是澄清透明、呈微酸性的体液，正常人每天可分泌1.0～1.5 L。唾液腺具有高通透性，被丰富的毛细血管所包绕，这使得血液中的分子与邻近的唾液腺细胞中的分子能进行自由交换。因此，唾液中不仅含有与血液相同的酶、激素、抗体以及生长因子等蛋白质，还包括mRNA、miRNA和DNA等遗传信息，且这些物质在唾液和血液中的表达水平密切相关。血液是传统的液体活检材料，基于血液循环DNA的基因突变检测和基于血液循环肿瘤细胞的分子生物学分析在肿瘤诊断、临床治疗及预后评价方面具有重要作用。血液中的蛋白质及核酸进入唾液，使其含有与机体生理病理状态相关的生物学信息，因此唾液同样是有前景的液体活检材料。

与血液相比，唾液活检有独特的优势，取材方便、无创且可避免血源性的感染。以往认为由于解剖位置的特殊性，唾液活检只对头颈部肿瘤(如口腔癌)具有诊断价值，而越来越多的实验证实它同样可应用于机体远端的肿瘤(如胰腺癌、肺癌、乳腺癌、肝癌)[6]，由此看出唾液活检不受肿瘤空间位置的限制。而且，肿瘤发生发展过程中蛋白质、核酸的变化均能由唾液活检进行实时监测，不受肿瘤进展时间的限制。本研究以唾液中发现的肿瘤标志物为线索，从检测技术、临床应用两个层面概括唾液活检在肿瘤领域的研究现状，并对其发展的前景与挑战进行展望。

一、唾液活检检测技术研究

唾液活检的主要目的是探寻蛋白质含量的变化特征以及核酸分子遗传信息的改变，以了解机体在正常与肿瘤状态下的差异。近年来随着质谱分析技术(mass spectrometric analysis，MS)以及二代测序技术(next generation qequencing，NGS)的快速发展，对唾液蛋白质组学以及基因变异的研究已获得重大突破。

(一)蛋白质检测技术

唾液蛋白质成分具有复杂性，以往大都用二维聚丙烯凝胶电泳(PAGE)的方法进行分离，随着质谱分析仪的发展，蛋白质得以更精确地分类鉴定，美国加州大学洛杉矶分校(UCLA)已建立起唾液蛋白质组数据库，包含的蛋白质达千余种，且综合信息不断地更新，形成了一个可在全世界范围内进行交流的平台，对口腔生物学、唾液诊断学等领域的研究有巨大推动作用[7]。

(二)RNA检测技术

唾液RNA的检测方法主要是芯片技术，其不足之处在于50%的唾液RNA呈片段状，不携带Poly－A尾巴，易被降解；此外在RNA扩增试验中多采用随机启动的方法，导致了RNA分子信息的丢失。Wong. D T. 团队研发了一种用于唾液mRNA扩增的试剂盒－Express Art TRinucleotide mRNA Amplification Kit，其特点是用锚定寡核苷酸与三核苷酸引物的混合物替代传统的寡核苷酸引物，能对不携带Poly－A尾巴的RNA片段进行有效的逆转录；且三核苷酸引物使扩增循环中的逆转录都遵循统一严格的启动，避免了随机扩增带来的RNA信息的丢失。应用此方法鉴定的唾液外显子核心转录组包括1 370个探针组合，代表了85%的唾液样本中851个特定基因。

(三)基因变异检测技术

1．基因突变检测技术：

目前唾液基因突变检测的方法包括普通PCR和微滴式数字PCR(ddPCR)相关的方法。唾液中突变的模板浓度较低，普通PCR容易出现假阴性，ddPCR通过对样品的随机分布进行分析，使生物标志物的研究实现了精确地"数字化" 。以表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)突变为例，在T790M突变的非小细胞肺癌人群中，AZD9291的治疗往往受困于获得性C797S突变引起的继发性耐药。应用ddPCR技术对C797S进行分析，可检测到0.05%～0.1%的突变频率。

此外，值得一提的是处于研发状态的电场诱导释放定量技术(Electric Field－Induced Release and Measurement，EFIRM)，该该技术在检测p.E746－A750缺失时，可检测低至0.1%的突变频率；检测L858R时，1%的突变可被检测到，在非小细胞肺癌组检测的唾液和血浆中EGFR突变具有强相关性(p.E746－A750缺失：R＝0.98, P<0.000 1；L858R点突变：R＝0.99, P<0.000 1)。

2．DNA甲基化检测技术：

肿瘤组织中的DNA甲基化改变，通过灵敏的方法同样可在唾液中检测到。Illumina公司的Golden Gate DNA甲基化平台(DNA Methylation Cancer Panel I)目前广泛地应用于甲基化检测，在样本中的DNA被重亚硫酸盐转化后，探针可以准确地探测到甲基化位点[11]。近来兴起的全基因组DNA甲基化测序将重亚硫酸盐方法和Illumina HiSeq高通量测序平台相结合，可达到单碱基分辨率，快速分析每个胞嘧啶的甲基化状态，从而构建精细的全基因组DNA甲基化图谱。

二、唾液中潜在的生物标志物及临床应用研究

(一)蛋白质类标志物

人类唾液中含有多种蛋白质，虽然含量仅为血液中的30%[6]，但唾液仍然被认为是富含蛋白质标志物的液体活检材料。

据报道，唾液中的白细胞介素－8、肿瘤坏死因子－α以及转铁蛋白[12,13,14,15]等可作为检测口腔癌的标志物，实验显示：白细胞介素－8在区分口腔鳞状细胞癌患者和健康人时曲线下面积(Area Under The Curve，AUC)值最高，为0.749。近来发现，原发性口腔鳞状细胞癌患者的唾液Cyfra21－1水平[(85.95 ± 78.00)μg/L]高于健康人[(42.27 ± 40.84)μg/L，P＝0.009]；且术后复发患者为[(130.95± 66.38)μg/L]，高于无复发人群[(74.84 ±63.45)μg/L，P＝0.023。以上表明，唾液中蛋白质浓度变化一定程度上反映了口腔癌发生发展的进程，这对于口腔癌的筛查、诊断以及复发等具有重要参考价值。

在乳腺癌研究中，Bigler等的结果显示唾液中c－erbB－2蛋白浓度在治疗后显著降低(t＝4.245，P<0.000 1)，且随着治疗的进行持续降低。相似地，乳腺癌患者唾液CA15－3水平[(5.26 ± 4.12)U/mg]显著高于健康组[(2.27± 1.54) U/mg]和乳房良性疾病组[(2.22±1.95) U/mg，P<0.05]。

(二)核酸类标志物

1．RNA标志物：

在健康人和患者的唾液中能检测到3 000余种mRNA和300种miRNA[20,21]，有学者评估了唾液转录组学标志物对胰腺癌患者的诊断效能，发现12种mRNA水平在胰腺癌患者和健康人之间的差异有统计学意义(P<0.05)，联合应用其中的4种：KRAS、MBD3L2、ACRV1和DPM1，能够对这两个群体进行区分，AUC值为0.971，敏感性和特异性为90%和95%[22]。另有研究发现，唾液中miR－9、miR－134和miR－191在区分头颈部鳞状细胞癌患者和健康人时具有很好的效能，AUC值分别为0.85(P<0.000 1), 0.74(P<0.001) 和0.98(P<0.000 1)。

2．DNA标志物：

基因突变是癌症患者DNA分子中常见的遗传变异，现已成为癌症诊断、靶向治疗以及疗效监测的重要指标。近年来，随着游离DNA(cfDNA)在液体活检领域成为热点，唾液作为一种新兴的检测cfDNA突变的材料受到了广泛关注。在40例晚期非小细胞肺癌患者的唾液样本中，探索19号外显子p.E746－A750缺失和21号外显子L858R点突变的诊断效能，AUC值分别为0.94和0.96[10]，这表明唾液cfDNA的EGFR突变检测可作为非小细胞肺癌的诊断指标应用于临床。

在表观遗传学领域，DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一。Viet和Schmidt[11]研究了口腔鳞癌患者唾液DNA的甲基化位点，构造了甲基化标志物池，其敏感度为62%～77%，特异度达83%～100%。另外，有研究发现随年龄的增长DNA甲基化模式发生改变，EDARADD、TOM1L1和NPTX2三个基因的甲基化与年龄的增长呈线性相关[24]，这说明基于唾液的甲基化检测筛查对年龄相关性疾病可能具有一定可行性。

综上，新技术的发展极大地促进了唾液活检的发展，为实现其在肿瘤领域的应用奠定了坚实基础，我们根据相关技术与临床应用将唾液活检的研究现状进行汇总整理，见表1。

三、唾液研究的前景和挑战

过去十年时间里唾液的优点不断被实验所证实，促进了唾液诊断学无价值论向前景论转变。目前初步结果显示，唾液不但可以用来诊断口腔癌等头颈部区域的局部肿瘤，对于肺癌、胰腺癌和乳腺癌等远处肿瘤同样具有诊断价值，然而仍需进一步的科学验证为唾液的诊断能力提供支持。基于大量研究者所做的努力，唾液诊断学研究呈现出空前的盛况，在未来医学中唾液检测将会成为体格检查的项目，以协助临床医生对疾病进行筛查和实时监测。

然而将唾液检测应用到临床还要克服众多限制条件，比如，相比理论我们实际可获得的唾液体积有限，以及唾液中尚有大量的标志物处于未知阶段。未来将唾液肿瘤标志物作为检测项目，良好的质量控制是保障检测结果快速、准确、及时的基础，质量控制的核心是对分析前、分析中和分析后各因素实施严格的系统性规范，主要包括分析前标本采集、运输和储存(温度要求)等条件的一致性，分析中标准化、分析后参考区间、医学决定水平和解释性备注等的标准化，最终目标是使在不同时间、地点及分析系统上得到的检测结果具有分析质量和临床要求上的等同性。当前的首要挑战是探索唾液中的标志物并通过具体实验确定其特异性和敏感性、实现收集方法和处理方法的规范化，进而解决质控样本标准化及商品化的问题。一旦攻克了这些难题，并在大型临床试验中加以验证，唾液诊断学才能最终获得FDA的批准而广泛应用于临床。

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