核酸检测是新型冠状病毒肺炎确诊的重要手段。为了解我国新型冠状病毒（2019⁃nCoV）核酸检测的开展现状及质量状况，国家卫生健康委临床检验中心（以下简称“临检中心”）于2020 年 3 月 16 日~24 日开展了 2019⁃nCoV 核酸检测室间质量评价，并将检测结果进行了统计分析。

       本次临检中心下发了12个质评样本，均为国家卫生健康委临床检验中心制备，为基因工程方法制备的噬菌体病毒样颗粒模拟样本，无生物传染危险性，其浓度采用数字PCR定量而来，样本相关的信息如下：

全国返回855个实验室结果

       本次共计 1296 家实验室报名，考虑到物流邮寄、自建方法信息的完整性等因素，实际接受报名实验室数共计 889 家，包括疾病预防控制中心、二级或三级公立医疗机构（含综合医院、专科医疗机构、妇幼保健机构）、独立医学实验室、海关所属国际旅行卫生保健中心、试剂研发厂家、科研院所等，共覆盖全国 31 个省份（含自治区、直辖市）。
       本次共计收到 855 家实验室的结果，其中有效结果的实验室数为 844 家（即回报结果完整、在截止日期内回报的结果），采用单试剂检测的实验室 759 家，采用两种或两种以上试剂检测的实验室 85 家，不同试剂检测结果 931 份。

评价原则和结果

       “新型冠状病毒核酸检测”室间质量评价的评价原则如下：

       （1）假阴性结果：500 个copies/mL 以上浓度的 2019-nCoV 样本均要求检出， 包括202002、202004、202008 和 202011，未检出为假阴性结果。
       （2）假阳性结果：2019-nCoV 阴性样本，包括其它冠状病毒阳性样本，均应报告 2019-nCoV 阴性。报告 2019-nCoV 阳性为假阳性结果。
       （3）PT 成绩计算： 202010 号样本不计分。

       202001、202002、202004、202005、202006、202007、202008、202011、202012号样本均要求与 2019-nCoV 预期结果相符，完全相符判定为实验室为合格；否则，为不合格。采用两种试剂检测的实验室，以最终结果判定实验室成绩是否合格（不单独评价各试剂检测结果）。

       （4）质评结果：本次质评中，共计收到 844 家实验室的有效结果（即回报结果完整、在截止日期内回报的结果），其中合格实验室 701  家（83.1%），不合格实验室 143家（16.9%）。

结果统计

（1） 各样本总体符合率和复检率

（2）各实验室使用的方法学差异

       使用方法包括包括实时荧光 RT-PCR、PCR-基因芯片、PCR-飞行时间质谱、转录介导的恒温扩增、数字 PCR 和高通量测序方法（包括宏基因组测序）。但是实验室基本上都使用实时荧光 RT-PCR 方法，其它方法由于回报结果少，100%符合也不能说明该方法具有优越性。

注：核酸检测的假阳性通常由于标本间交叉污染和实验室扩增产物遗留污染，但也可能是由特定试剂引物探针本身的特异性问题所致。

（3）各厂家产品差异
       不同试剂对 202011、202008、202004 和 202002 号阳性样本的符合率和复检率见表 6，202010 号样本（128 copies/mL）共计 6 家实验室检出，2 家为圣湘生物、2 家为达安基因、2 家为自建方法（实时荧光 PCR、数字 PCR 法各 1 家）。
       核酸检测试剂：97.5%（908/931）的回报结果使用实时荧光 PCR 法，各试剂的分析敏感性存在差异。NMPA 批准的试剂各阳性样本（8×10 4 copies/mL， 1.6×10 4copies/mL, 3.2×10 3 copies/mL, 640 copies/mL）检测的符合率总体好于使用自建方法的实验室。

阳性样本检测结果的符合率和复检率

不同品牌的试剂各靶基因检出率

       各试剂不同靶区域的敏感性也存在差异。本次质评样本为 ORF 区和 N 区连接在一起的病毒样颗粒，因此 ORF 和 N 区的数量是完全一致的，但是试剂对两个区域检测的阳性率差异明显。以回报结果数>10 份的试剂来看，总的来说，N 区的阳性率高于 ORF 区，样本越弱，这一现象越显著。

       目前各试剂有单靶标、双靶标和三靶标检测的方式，在疫情初期临床病例数不足，方法设计尚无法进行充分的验证。但是在现阶段，试剂厂家应该已有一定数量的临床数据，用来论证一些方法设计的依据是否科学。
       比如，要求两个靶基因同时阳性，那么单个靶基因阳性的样本，其中假阳性的比例有多少？造成假阳性的原因是什么？单靶标阳性必须要复检一致，才能判定阳性，那么如果不复检，会造成假阳性的比例有多少？造成假阳性的原因是什么？双靶标或者三靶标检测的作用，主要是为了提高检测的敏感性还是特异性？是否存在多引物探针之间的竞争或者干扰？单靶标阳性的原因是什么？
      本次“ 全国新型冠状病毒核酸检测室间质量评价” 主要评价实验室对2019-nCoV 核酸检测的能力，重点考察实验室检测的分析性能，包括分析敏感性和分析特异性。
      室间质评采用基因工程方法建立的噬菌体病毒样颗粒模拟样本（本实验室制备），无生物传染危险性。该样本适用于 NMPA 批准的新型冠状病毒核酸检测试剂，19 种未批准的商品化试剂和 32 家不同实验室自建方法。
      

本次质评，共计 844 家实验室回报有效结果，实验室总体检测情况良好，合格实验室 701 家（83.1%）。同时也反映出一些问题，具体如下。
 
(1) 假阴性结果
       本次质评含有 5 份阳性样本，分别为8×10 4  copies/mL，1.6×10 4  copies/mL,3.2 ×10 3 copies/mL, 640 copies/mL 和128 copies/mL。临床研究表明，呼吸道和非呼吸道样本中新型冠状病毒载量平均为3.21×10 4  copies/mL（2.21×10 2~4.71×10 5copies/mL），呼吸道样本中新型冠状病毒载量平均4.33×10 4  copies/mL。
       另一研究表明，痰液样本浓度较高（中位数 7.52 × 10⁵ copies/mL），咽拭子样本浓度较低（中位数 7.99 × 10⁴ copies/mL）。由于能获取痰液的患者有限，临床上鼻咽拭子采样更为普遍。因此，本质评样本基本符合临床样本中病毒载量的情况。
       本次质评要求实验室能够检出8×10 4 copies/mL，1.6×10 4 copies/mL, 3.2×10 3copies/mL, 640 copies/mL 四个浓度水平的样本。各临床实验室在 1.6×10 4 copies/mL 以上浓度水平，符合率均可以达到97%以上，主要的问题存在于对3.2×10 3 copies/mL 和 640 copies/mL 两个弱阳性样本检出能力。导致检测假阴性的原因涉及核酸提取和检测两个过程。
       尽管实验室一般会很关注检测试剂的性能，但实际上核酸提取试剂的质量也是检测成功的关键环节之一。本次质评中实验室使用的核酸提取方法包括手工-柱提取法、手工-磁珠提取法、自动化仪器-柱提取法、自动化仪器-磁珠提取法和一步法等，各实验室使用的核酸提取试剂种类超过 40 种，各检测试剂均存在与多个核酸提取试剂搭配使用的情况。磁珠法核酸提取试剂逐渐成为主流，厦门普睿迈格生物科技有限公司作为专业的磁珠供应商，在核酸提取磁珠应用方面积累较多经验，为核酸提取试剂生产商提供完善配套。
       核酸检测从提取到完成扩增检测是一个体系，但是如此多的核酸提取试剂，各种不同的操作程序，各实验室的检测体系实际上并不相同。因此，即使采用同一核酸检测试剂，但由于核酸提取试剂的不同，检测的分析敏感性也必然会存在差异。
       相同核酸提取纯化试剂，各实验室的检测程序也有所不同。使用“中山大学达安基因股份有限公司核酸检测试剂”的 224 家实验室，58 家使用配套的“达安基因核酸提取纯化试剂”，各实验室使用的核酸提取的样本量均为 200µL ，但洗脱体积包括 40、50、60、80、90 和 100µL 等。
       实验室方面：各实验室人员提取的操作能力存在差异，个别实验室所有阳性样本均未检出。造成这一结果的主要原因，很可能是人员操作的问题，当然也不排除核酸提取试剂某一批次质量存在问题的可能性。部分实验室尽管检出阳性样本，但是从报告的 Ct 值来看，实际上也存在较大差异。因此实验室操作人员的培训有待加强。
       一些实验室在检测过程中缺乏质量控制及对单靶标阳性样本解读的能力不足，这部分实验室多开展临床检测时间不长，或者地区流行率低，日常检出阳性样本数极少。甚至使用相同试剂的实验室对单靶标的处理方式也不同。

(2) 假阳性结果
      从质评结果来看，假阳性率较低，出现 2 例或 2 例以上假阳性的实验室共 7 家（0.8%，7/844）。实验室污染（扩增产物遗留污染和标本间交叉污染）在少数实验室存在。部分试剂存在和其它冠状病毒的交叉反应。
      综上所述，我国目前临床实验室对 2019-nCoV 核酸检测能力较强，同时也存在需要改进的方面，建议各试剂厂家根据目前临床应用情况，总结临床性能的数据；自建方法应加强对试剂性能的评价；临床实验室在开展检测前或更换试剂批号时，应进行性能验证，以发现不同试剂批号存在的差异以及验证实验室检测能力；临床实验室应使用参与核酸提取过程的弱阳性样本和多份（如 3 份） 阴性样本，进行室内质量控制，以有效监测实验室对弱阳性样本的检测能力和实验室污染；临床实验室人员应加强实验操作和结果解读能力的人员培训。


参考资料：临检中心《全国新型冠状病毒核酸检测室间质量评价结果报告》。
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