摘  要

糖蛋白，作为翻译后产物的一个重要组成部分，在各种生物过程中扮演着关键角色，比如信号传导和免疫反应。糖基化异常可能导致糖蛋白的结构和功能发生变化，这与多种疾病的发生和发展密切相关。因此，探索蛋白质糖基化可以揭示疾病表现背后的机制，并为创新的诊断和治疗策略铺平道路。然而，由于糖基化含量低和结构复杂，临床糖蛋白质组学的研究充满了挑战。最近基于质谱的临床糖蛋白质组学的发展提高了我们在临床样本中识别异常糖蛋白的能力。在这篇综述中，我们旨在提供临床糖蛋白质组学方法和应用的基础原理和最新进展的全面概述。此外，我们讨论了糖蛋白在各种疾病中的典型特征、潜在功能和机制，如脑部疾病、心血管疾病、癌症、肾脏疾病和代谢性疾病。此外，我们强调了临床糖蛋白质组学未来发展方向的潜在途径。这篇综述中提供的信息将增强对临床糖蛋白质组学方法和疾病理解，并促进病理机制的阐明以及新的诊断生物标志物和治疗靶点的发现。

引  言

生命科学进入了后基因组时代，并启动了人类蛋白质组计划。蛋白质组学涉及在整体水平上研究细胞、组织或生物体蛋白质组的组成和变化，并阐明生物体中所有蛋白质的表达模式和功能模式。然而，翻译后修饰（PTMs）增加了蛋白质结构的复杂性，增强了功能，细化了调节，并增加了特异性。糖基化，作为真核生物蛋白质最丰富和最多样化的形式，指的是将糖链附着到生物分子（蛋白质、脂质和核糖核酸）上的复杂过程，这是一个关键的修饰，可以在这些基本生物分子的产生过程中或产生后发生。它由糖基转移酶催化，主要发生在内质网（ER）和高尔基体中。超过一半的人类蛋白质组分是糖基化的，包括美国（US）食品药品监督管理局（FDA）批准的肿瘤生物标志物（如前列腺特异性抗原[PSA]和甲胎蛋白[AFP]）。因此，糖蛋白在各种生理和病理过程中发挥着关键作用，凸显了它们在复杂生物系统中的重要性。蛋白质糖基化可以分为O-糖基化、N-糖基化、OGlcNAcylation、C-mannosylation、糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定等。在这篇综述中，我们重点关注两种最常研究的糖基化。N-糖基化发生在天冬酰胺上的Asn-Xxx-Ser/Thr/Cys（Xxx为任何不同于脯氨酸的氨基酸）基序上，有三个主要的N-糖链类型（高甘露糖型、混合型、复杂型），而O-糖基化发生在羟基上，主要是苏氨酸和丝氨酸，有八个O-糖核心结构（从核心1到核心8）（图1A）。深入糖基化领域，糖蛋白质组学已成为蛋白质组学的一个专门子领域，专注于在蛋白质组水平上识别和表征糖基化事件。因此，临床糖蛋白质组学已成为糖蛋白质组学的一个子领域。在此，我们将糖蛋白质组学定义为将先进的糖蛋白质组技术与其他尖端技术相结合，分析临床样本，旨在寻找糖蛋白、糖肽、糖位点和糖链的异常表达。

临床糖蛋白质组学的目标是将基础发现转化为临床应用，从而在各种疾病的预防和治疗方面取得重大进展。临床糖蛋白质组学研究面临众多方法学挑战。蛋白质糖基化的低丰度、复杂性、微宏观异质性和高动态变异性需要使用液相色谱串联质谱（LC–MS/MS）进行位点特异性糖基化表征。由于其在高通量和高灵敏度识别糖基化方面无与伦比的优势，LC–MS/MS已成为糖蛋白质组学工具箱中不可或缺的工具。近几十年来，LC–MS/MS不仅在糖蛋白的复杂分析中展示了其价值，而且还巩固了其在临床诊断中的重要工具角色。然而，临床糖蛋白质组学领域需要在检测准确性、灵敏度、进行原位实时分析的能力、对样本量的要求更小和检测速度更快方面进行改进。因此，临床样本处理方法的进步、质谱技术的进步和分析软件的改进是必要的。近年来，大量的工作致力于开发相关方法和技术，以提高糖蛋白质组学研究的质量。

有三种主要的策略用于探索糖蛋白质组，每种策略都提供了对糖蛋白结构和功能的独到见解（图1B）。首先，自上而下策略主要用于研究整个糖蛋白，包括重组糖蛋白和单克隆抗体（mAbs）。它可以呈现整个糖蛋白的一般特征，但不能提供糖基化的详细信息。其次，中间策略将焦点缩小到糖蛋白的亚单位或更长的糖肽。与自上而下策略相比，它可以确认更完整的序列和糖型位置。第三，自下而上策略是在临床糖蛋白质组学中最常用的策略。通过分析化学或酶法释放的糖链，可以获得糖蛋白质组上所有糖链的组成和结构信息，但可能会丢失糖位点信息。尽管分析裸露的糖肽或截短的糖肽可以识别糖位点和糖链占据的程度，但它不提供关于天然糖链组成和结构的信息。位点特异性糖基化分析对于理解糖蛋白中糖基化的功能意义至关重要。它可以通过分析完整的糖肽（IGPs；带有N/O-糖链的糖肽）来实现，因此这种方法已成为临床糖蛋白质组学的主流。

这篇综述提供了临床糖蛋白质组学领域的进展的全面概述和讨论，特别关注用于分析位点特异性糖基化或IGPs的尖端方法。在分析过程中的各个环节取得了显著进展，包括临床样本的准备、IGPs的富集，以及通过LC–MS/MS和专业软件检测IGPs。这些进展已经彻底改变了糖蛋白质组学领域，使研究人员能够在单一实验中识别数百到数千个糖位点或IGPs。不同类型的糖基化在生理和病理过程中可能发挥不同的作用。N-糖基化可以影响蛋白质的折叠、稳定性、溶解性、免疫原性、半衰期和药物属性，并且广泛参与细胞识别、细胞粘附、细胞转化、调节、信号传导、免疫反应等生理过程。O-糖基化在蛋白质分泌、聚集、相分离、免疫原性和半衰期中发挥着不可或缺的作用，并且广泛参与细胞-细胞相互作用、跨膜受体激活、病原体结合和免疫细胞调节等多种生理功能。因此，蛋白质N/O-糖基化异常变化与多种疾病的发生和发展密切相关。

临床糖蛋白质组学方法和技术的发展促进了其在各种疾病中的应用，如脑部疾病、心血管疾病（CVDs）、癌症、肾脏疾病和代谢性疾病。通过对人类尿液、血液、脑脊液（CSF）、病理组织等临床样本中存在的生化化合物的细致检查，LC–MS/MS促进了对各种疾病诊断和理解的突破。其能够提供对健康和疾病分子基础的精确和全面的洞察，突出了LC–MS/MS在推进科学研究和临床实践方面不可或缺的作用。最近的进步导致了糖蛋白质组技术在临床诊断和治疗干预的整个谱系中的应用。这种尖端方法在识别疾病生物标志物、探索病理代谢物和开发专门针对糖基化过程的疫苗方面发挥了关键作用。例如，在肾脏疾病的背景下，研究发现不规则的糖基化模式与肾脏疾病的进展之间存在显著联系。具体来说，异常的糖基化与推动肾脏疾病的机制密切相关，突出了精确的糖基化模式在维护肾脏健康中的关键作用，并为靶向治疗策略铺平了道路。

在这篇综述中，我们总结并讨论了临床糖蛋白质组学中的新兴趋势，以说明该领域如何从专注于识别糖基化底物的研究转向研究特定机制和疾病状态。这篇综述概述了糖蛋白质组技术的基本原理和逻辑，并进一步调查了这种尖端技术对科学领域的当前贡献，强调了其在转变不同疾病诊断和治疗方面的能力。通过全面的讨论，这篇综述强调了糖蛋白质组学在增强我们对多种疾病的理解和管理中的关键作用，最终导致更好的患者结果。这种探索不仅揭示了糖蛋白质组学的潜力，还强调了其在持续追求医学进步中的重要性。

图1：临床糖蛋白组学方法与疾病概述