定量蛋白质组学在过去十年中取得了长足的进步，成为生物和生物医学研究的重要工具。然而，由于蛋白质组的复杂性，稳健的蛋白质组范围测量仍然具有挑战性。值得注意的是，蛋白质组的动态范围很广，细胞蛋白质组跨越 7 个数量级，而一些生物流体（如血浆）跨越 10 个数量级。此外，随着该领域扩展到包括单细胞测量，超高灵敏度比以往任何时候都更加重要。尽管技术取得了进步，但在整个动态范围内的定量灵敏度、准确度和精密度仍有改进的空间。虽然经常研究大量表征良好的蛋白质，但对许多低丰度蛋白质知之甚少。 因此，质谱 （MS） 已成为全蛋白质组定量测量的主要方法; 然而，进一步推进该领域需要不断改进硬件和数据采集技术。

MS 为全面的蛋白质组范围研究提供了前景，但在整个动态范围内准确定量蛋白质仍然是一个尚未解决的挑战。最近的研究报道了可检测到大量蛋白质：在 44 分钟的运行中检测到多达 7700 个蛋白质，在单次 120 分钟的运行中检测到 10,000 个蛋白质， 以及使用生化分级分离的超过 12,000 个蛋白质。 这些结果突出了测量低丰度蛋白质的难度越来越大。此外，这些研究各自实施了自己的错误发现率和可量化峰值阈值，因此很难比较这些结果。即使是 1% 的标准错误发现率 （FDR） 在不同的工具、工具和数据集中也可能具有截然不同的含义。不产生任何定量信息的测量会夸大数字，同时稀释统计功效。然而，许多蛋白质组学研究认为定量是理所当然的，很少有实验在显著的动态范围内对定量进行基准测试。因此，对新技术进行严格的分析评估，主要关注其定量能力，是技术开发周期的关键部分。

使用膜结合颗粒富集方法，我们使用 Orbitrap Astral 质谱仪在单次 70 分钟 LC-MS 运行中定量了 5163 种蛋白质。此处描述的基准测试展示了 Astral 质量分析仪在稳定定量 DIA 方面的强大功能。

为了评估 Orbitrap Astral MS 产生新的生物学见解的潜力，我们测试了它在血浆上的性能，血浆基质既常见又具有分析挑战性。 虽然分级分离和富集策略提高了血浆蛋白质组的覆盖率，纳米颗粒分级分离在 5 次运行中检测 1500-2000 个蛋白质，而其他方法在一次运行中可检测多达 2700 个蛋白质 ，但血浆蛋白质组仍然是一个艰巨的分析挑战。解决动态范围问题的两种主要方法是增加质谱仪本身的动态范围，或者使用富集或去除策略来减小我们正在测量的样品的动态范围。在这里，我们通过使用高灵敏度的 Orbitrap Astral MS 来测量细胞外囊泡富集样品中的血浆蛋白，从而应用这两种策略。

为了减小动态范围，我们使用了一种简单的基于磁珠的方案，该方案能够从血浆中富集细胞外囊泡 （EV）。由于大多数丰度血浆蛋白与囊泡无关或位于囊泡内，因此它们在 EV 富集过程中被耗尽。使用 MagStart高孔聚合物基质的组合富集 EV，该基质用作膜结合颗粒的分子“网”。磁珠的聚合物基质包含季铵盐表面化学成分，产生阳离子电荷（MagStart-SAX 磁珠）。多孔聚合物允许囊泡和生物分子嵌入珠子的体积内，正电荷提供了一种根据电荷区分囊泡和脂蛋白颗粒的方法。该方案导致已知 EV 标志物的富集约 20 倍，常见血浆蛋白的消耗约 95%。使用该方案，Wu 等人能够将总血浆中的 1088 个蛋白质检测（使用血浆 EV 生成的文库）提高到富集血浆中的 4163 个。

为了评估基于 Astral 的仪器中的血浆蛋白质组覆盖率，我们评估了在富含 EV 的血浆和总血浆中具有短 （30 分钟） 和长 （60 分钟） 梯度的多种采集方法的定量性能。我们对每个梯度使用了多个隔离窗口大小和进样时间来评估这些参数的优点。对于 30 分钟梯度，我们在 187 Hz（最大进样时间 3.5 ms，第 2 个隔离窗口）、90 Hz（最大进样时间 10 ms，第 4 个隔离窗口）和 50 Hz（最大进样时间 20 ms，第 4 个动态 DIA 窗口）下操作仪器。对于 60 分钟的梯度，我们测试了两种方法，均在 60 Hz（最大注射时间 15 ms）下运行，一种使用 4 Th 静态隔离窗口，另一种使用 2 Th 动态隔离窗口。

不出所料，我们发现较长的梯度比较短的梯度产生更多的肽和蛋白质水平鉴定。60 min 梯度、4 Th分离窗口和 15 ms 最长进样时间产生了最多的肽和蛋白质水平检测结果，从 5163 个蛋白质中获得了 44,668 个肽。使用 30 min 梯度和 4 Th 分离窗口和 10 ms 的最大进样时间，我们从 4704 种蛋白质中检测到 37,534 种肽。通常，减慢采集速度以允许更长的进样时间可以提高技术精度，尽管缩短 dDIA 的质量范围会减少肽和蛋白质检测的数量。这里评估的所有方法都检测到了 4200 多种蛋白质，具有很高的技术精度，这表明 Astral 非常适合这些类型的测量。此外，Astral 能够检测某些标记蛋白的富集和耗竭，这些标记蛋白相对于总血浆跨越较宽的动态范围）。 使用相同的富集方案，Wu 等人在 Thermo Scientific Orbitrap Eclipse MS 上以 110 分钟的梯度检测到来自 4163 种蛋白质的 37,942 种肽。 Orbitrap Astral MS 能够在 30 分钟的梯度中检测更多的蛋白质和相似数量的肽，这突出表明 Astral 分析仪提高速度和灵敏度的一个好处是能够在保持甚至增加覆盖率的同时提高通量。

虽然技术精度和与已知生物学的一致性表明 Orbitrap Astral MS 产生的测量结果有意义，但很明显，这些检测中有一定比例可归因于背景信号和化学噪声。因此，为了确定高质量肽和蛋白质的比例，我们过滤了至少具有三个共洗脱通道的肽的结果。应用该过滤器后，肽和蛋白质的数量仅略微减少，使用 dDIA 方法从 4453 个蛋白质中达到最大值 31,373 个肽。过滤具有多个协变通道的肽的一个结果是消除了具有化学干扰的肽，从而提高了变异系数。在这里，增加进样时间可以改善离子统计数据，从而提高灵敏度和精密度。同样，缩小隔离窗口可以提高测量选择性并减少化学干扰。增加的进样时间和提高的选择性都导致了检测限的提高。即使使用相对严格的质量过滤器，这里介绍的血浆蛋白质组覆盖率也是前所未有的。