采用链霉亲和素磁珠（PuriMag G-strep 货号PMG015）进行RNA pull-down 

RNA pull-down assay using Streptavidin magnetic beads 

1. RNA pull-down 第一天——生物素探针标记RNA

1）前期准备：取出Pierce™ RNA 3' End Desthiobiotinylation Kit，将试剂盒中的PEG及DMSO置于常温，其余组分置于冰上融化，也可将PEG放于37摄氏度融化；打开PCR仪；

2）依照RNA母管含量，用DEPC水溶解RNA，我们通常是10ug/管，用10μl DEPC水溶解。同时溶解试剂盒中Control RNA作为阴性对照；

3）取对照RNA及目标RNA各5 μl,放于200 μl的PCR管中，每管可加1 μl DMSO，混匀后置于PCR仪上，85℃，5min,然后立即置于冰上5min;（DMSO的加入可有助于打开RNA的二级结构，提高RNA ligation的效率）

4）按照下表配制探针标记反应的体系：

成分                                                  体积（μl）    

water                                                         3
10X RNA ligase recation buffer                      3
RNase inhibitor                                           1
Non-labeled RNA                                         5

Biotinylated Cytidine Bisphosphate                1
T4 RNA Ligase                                            2
PEG 30%                                                  15
Total                                                        30

5）混匀上述反应体系，之后放至PCR仪内， 16℃，4h至过夜。反应时间的延长可提高连接效率；

6）连接反应结束后，向每管加400μl nuclease free-water;

7）每管加300 μl酚氯仿提取标记成功的RNA；涡旋后最大转速离心15min,小心将上层水相移取到新的EP管中；

8）加10 μl 5M NaCl ,2 μl糖原，以及600 μl 预冷的100%乙醇，放于-20℃或-80℃沉淀，可沉淀过夜。


2. RNA pull-down 第二天

1）前期准备

·DTT ，蛋白三联室温溶解；
·streptavidin magnetic beads;(PuriMag G-strep磁珠)
·RNase Inhibitor;
·细胞，10cm大皿若干，长至约80~90%密度；

2）RNA抽提

a)将沉淀过夜的RNA取出，4℃，最大转速离心30min，离心后可见管底的白色沉淀，及为RNA；

b)小心移取上清，用1ml 70%乙醇洗涤,8000rpm 离心10min,之后吸净管内液体，空气中晾干RNA，若乙醇未挥发完全，将影响下游实验效率；

c)每管加20 μl nuclease free-water溶解RNA，之后将RNA放于PCR仪中，95℃，5min使其变性，之后立即置于冰上，备用。

3）细胞裂解

a)弃去培养基，用预冷的PBS洗3次，吸去上清；

b)每个大皿中加入200μl cell lysis buffer A (加蛋白三联)；

c)用细胞刮刀刮下细胞，收集至EP管，液氮中三冻三融；

d)离心，4℃，3000rpm，离心10min；

e)转移上清至新的EP管中，置于冰上；可加200U/ml RNase Inhibitor;

f)取10-20 μl左右上清至新管中，作为实验input组。


4）magnetic beads （PuriMag G-strep 货号PMG015）预处理

a)涡旋混匀beads；

b)每管取400μl beads(如本次实验中，control RNA 及目的RNA各1管)，置于磁力架上，吸去上清；

c)用800μl 1X binding & washing buffer ,洗3次，吸去上清；


5）RNA 与beads结合

a)向上一步的beads中加入400μl 2X binding & washing buffer；

b)向上一步中加入20μl RNA ,再补380μl DEPC水，使其终体积为800μl；

c)室温慢速旋转20min,使beads与RNA充分结合；

d)将上一步的管子置于磁力架上，吸去上清；

e)用800μl 1X binding & washing buffer（含RNase Inhibitor, 1U/ μl）,洗3次，吸去上清；

f)用cell lysis buffer A 洗一次beads, 吸去上清，注意不要让beads干掉。


6）RNA与蛋白相互作用

a)向上一步已处理好的beads中每管加入500μl 细胞裂解液（第3步）；同时向每管加入RNase Inhibitor, 1U/ μl；

b)4℃慢速旋转2h,使beads与细胞裂解液充分结合；

c)磁力架上吸去上清，用400 μl新鲜配制的cell lysis buffer A（+RNase Inhibitor+蛋白三联），洗5次beads;

d)吸去上清，用25μl预冷的0.1% SDS溶液重悬beads，加6.25μl 的5X蛋白上样缓冲液，100℃金属浴煮10min.之后立即置于冰上5min,再置于磁力架上吸取上清至新的EP管中，准备蛋白上样。


7）蛋白的检测

可采用western blot 或质谱继续下游蛋白的验证。

以上就是的RNA pull-down技术的超详细秘籍啦！

用于pull-down的链霉亲和素磁珠请参考:

 http://www.purimagbead.com/Product/8271042221.html (200nm链霉亲和素磁珠)

http://www.purimagbead.com/Product/9728163513.html (1um链霉亲和素磁珠)