核酸提取方法的深度解读 提取操作关键点解读
来源：生物磁珠专家 2017-11-8 9:06:43 点击：
一、核酸
核苷酸单体聚合而成的生物大分子，是生物细胞最基本和最重要的成分。一般认为，生物进化即始于核酸，因为在所有生命物质中只有核酸能够自我复制。今天已知核酸是生物遗传信息的贮藏所和传递者。一种生物的蓝图就编码在其核酸分子中。核酸是1869年米歇尔(F. Miescher)在脓液的白细胞中发现的。他当时称之为核素。阿尔特曼(R. Altmann)于1889年认识其酸性后，定名为核酸。
二、核酸的分类和功能
核酸分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两大类。这两类核酸有某些共同的结构特点，但生物功能不同。
DNA贮存遗传信息，在细胞分裂过程中复制，使每个子细胞接受与母细胞结构和信息含量相同的DNA；RNA主要在蛋白质合成中起作用，负责将DNA的遗传信息转变成特定蛋白质的氨基酸序列。
核酸的基本结构单元是核苷酸，核苷酸含有含氮碱基、戊糖和磷酸3种组分。碱基与戊糖构成核苷，核苷的磷酸酯为核苷酸。DNA和RNA中的戊糖不同，RNA中的戊糖是D-核糖；DNA不含核糖而含D-2-脱氧核糖(核糖中2位碳原子上的羟基为氢所取代)。核酸就是根据其中戊糖种类来分类的，DNA和RNA的碱基也有所不同。
三、核酸的理化性质
RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离核酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L，DNA钠盐在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA。
四、细胞裂解
（一）裂解原理在核酸提取过程中，细胞裂解是非常重要的。
经典的裂解液几乎都含有去污剂 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境 (如 Tris)，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏 (如 EDTA)、维持核酸结构的稳定 (如 NaCl) 等。去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶，利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 裂解的，该方法已经成为了 RNA 抽提的主流，却不是基因组 DNA 抽提的主流。
（二）细胞的裂解方法
细菌细胞破碎方法有以下几种：
1）机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法。关于超声波处理法，要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间。
2）化学试剂法：用含SDS或CTAB的溶液处理细胞，在一定的pH环境和变性条件下,细胞破裂,蛋白质变性沉淀,核酸被释放到水相，pH环境则由加入的强碱(NaOH)或缓冲液( TE、STE等)提供，表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀,缓冲液中的一些金属离子螯合剂( EDTA等)可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子Mg2+ 、Ca2+ ,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。
3）反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。个人经验一般情况，37℃,3min，液氮3min,反复三次即可以。
4）酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶、蛋白酶K等，都可使细胞壁破碎，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质,促进核酸的分离。其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-(1 ,4) 键水解。蛋白酶K能催化水解多种多肽键,其在65 ℃及有EDTA、尿素(1～4mol/ L) 和去污剂(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X-100) 存在时仍保留酶活性,这有利于提高对高分子量核酸的提取效率。在实际工作中,酶作用、机械作用、化学作用经常联合使用。具体选择哪种或哪几种方法可根据细胞类型、待分离的核酸类型及后续实验目的来确定。
（三）裂解方法的评价
含蛋白酶的裂解方法，可以认为是抽提基因组 DNA 的首选。裂解包括膜蛋白的游离和与基因组 DNA 相连接的蛋白质的游离。蛋白酶的作用是使蛋白质变小，故而对蛋白质的游离有巨大的促进作用；同时，巨大的基因组DNA 是很容易“缠”住大分子的东西的，蛋白质被蛋白酶消化变小后，则不容易被基因组 DNA “缠”住，有利于蛋白质在纯化操作中的去除，使最终获得的基因组 DNA 的纯度更高。另外一个思路是，如果基因组 DNA 与蛋白质 “缠”在一起，在纯化的过程中有两种可能：如果基因组 DNA 的特性占优势，则纯化时以 DNA 的形式被保留下来，导致蛋白质的残留；如果蛋白质的特性占优势，则纯化时以蛋白质的形式被去除，导致 DNA 的损失。当然去污剂裂解方法，仍然在细胞基因组 DNA 抽提方面有优势，尤其是当得率和纯度要求不是最高，而经济性及操作简单很重要时。控制好裂解液/样品的比例是该方法成功的关键。该方法结合高盐沉淀，可以实现最简单的操作，但纯度及得率的稳定性可能会比用PC抽提的差一些。
高浓度蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 的裂解方法，是抽提 RNA 的首选。总 RNA 的抽提，最重要的是快速裂解细胞膜，至于与基因组 DNA 相连接的蛋白质的裂解以及基因组与蛋白质 “缠”住的问题，因为都不会对以后的纯化产生大的影响，可以不考虑。高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜，进而迅速抑制住细胞内的 RNA 酶，从而确保了 RNA 的完整性。除了极少量不适用该方法的样品 – 主要是植物，其它绝大部分样品的 RNA 的抽提，都可以以高浓度的蛋白质变性剂为基础的。当然有些样品，如肌肉，即使是 RNA 抽提，也强烈建议使用含蛋白酶的裂解液 (或者在操作中的某个时候使用蛋白酶消化蛋白质) ，原因在于这些样品中的蛋白质，是非常难以去除的。该方法是获得最大得率和最高纯度的基础。
含 CTAB 的裂解液，几乎成为富含多糖的样品，如细菌、植物的基因组 DNA 抽提的首选裂解方法。该方法成功与否与两个因素有关：一是CTAB 的质量，二是洗涤的彻底程度。CTAB 的质量对裂解效率有很大的影响，而且，似乎还说不清楚原因，因为即使是同一公司生产的纯度一样的 CTAB，批号不同，效果就可能差别很大。洗涤去除 CTAB 要比其它的盐难一些，同时，CTAB 的少量残留也会对酶活性有巨大影响，所以洗涤是否彻底也是该方法成功与否的关键。裂解时的温度，多使用 65℃；但如果发现降解严重或者得率太低，可以试一下 37℃ – 45℃这个相对低温的区域。
SDS 碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法，具有快速、得率高、几乎无基因组 DNA 污染的特点。控制好裂解液/菌体的比例和操作的温和是该方法成功的关键。蛋白质的沉淀效率在4℃会更好一些，所以，加入溶液 III 后在 4℃静置一段时间以及采用 4℃离心去蛋白质，都可以提高质量。该方法不一定要使用 PC 纯化，但结合 PC 纯化，可以获得纯度很高的质粒。RNA 的去除可以靠在溶液 I 中加入 RNase A (100ug/ml) 或者在最后的溶解液中加入 RNase A (25 ug/ml) 来实现。总的感觉是，在溶液 I 中使用 RNase A，RNA 的残留少一些。不过，经典沉淀几乎没有办法彻底去除 RNA 残留。另外，对大质粒 (50 kb 以上)，该方法可能会有问题。
PCR 模板的简易裂解方法，也是使用面很广的一类方法。该方法的特点是无须纯化，样品被裂解后即可直接取裂解液用于 PCR，非常快速。也正因为不纯化，所以，假阴性 (即没有扩增出来的阳性) 比例也比较高。该方法最简单的就是反复冻融法，简便快捷，不需任何化学试剂，冻融离心，PCR检测就可以了。如果使用裂解法，最简单的裂解液就是水，复杂一点的就会含有一些不会抑制后续的 PCR 反应，而且能提高裂解效率，甚至还可能部分消除样品内抑制 PCR 反应杂质的东西，如 Triton X-100、甲酰胺等。再复杂一点的就会含有诸如 Chelex 100 之类的能吸附部分杂质的介质。操作也非常简单，多使用温度的变化来实现样品的裂解，如煮沸、或者高温-低温的多次循环等。该方法最适合从一大堆样品中找出阳性样品，但却不适合用于判断某一个样品是阳性还是阴性。降低样品使用量可以提高阳性率，因为样品量的降低，同时意味着 PCR 的抑制物量的降低。
裂解液的用量原则是：确保能彻底裂解样品，同时使裂解体系中核酸的浓度适中。浓度过低，将导致沉淀效率低，影响得率；浓度过高，去除杂质的过程复杂且不彻底，导致纯度下降。另外，裂解液的用量是以样品中蛋白质的含量为基准的，而不是以核酸含量为基准，这一点务必牢记。
五、核酸纯化
就个人所知，目前在科研领域广泛使用的核酸纯化技术主要可以分为两大类：使用介质的和不使用介质的，使用介质的，一次就将核酸与其它所有杂质分开；不使用介质的，一定是首先将核酸和盐与大分子杂质分开，再通过沉淀核酸使核酸与盐分开 (PEG 沉淀和 LiCl 沉淀除外)。
1）经典的使用苯酚/氯仿抽提的纯化技术：细胞裂解后离心分离含核酸的水相，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25 ∶24 ∶1 体积) 混合液。依据应用目的，两相经漩涡振荡混匀(适用于分离小分子量核酸) 或简单颠倒混匀(适用于分离高分子量核酸) 后离心分离。疏水性的蛋白质被分配至有机相，核酸则被留于上层水相。酚是一种有机溶剂，预先要用STE 缓冲液饱和，因未饱和的酚会吸收水相而带走一部分核酸。酚也易氧化发黄,而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联；故在制备酚饱和液时要加入一特殊物质，以防止酚氧化。氯仿可去除脂肪，使更多蛋白质变性,从而提高提取效率。异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。核酸盐可被一些有机溶剂沉淀,通过沉淀可浓缩核酸,改变核酸溶解缓冲液的种类以及去除某些杂质分子。典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀，在含核酸的水相中加入p H5. 0～5.5 ，终浓度为0.3M的NaAc 或KAc 后，钠离子会中和核酸磷酸骨架上的负电荷，在酸性环境中促进核酸的疏水复性。然后加入2～2. 5 倍体积的乙醇,经一定时间的孵育，可使核酸有效地沉淀。其他的一些有机溶剂（异丙醇、聚乙二醇( PEG) 等）和盐类(10. 0mol/ L 醋酸铵、8. 0mol/ L 的氯化锂、氯化镁和低浓度的氯化锌等) 也用于核酸的沉淀。
2）使用离子交换介质的纯化技术：将裂解液过柱，核酸被联结在离子交换介质上；洗涤去除残留的杂质后，用高盐缓冲液将核酸从介质上洗脱下来。再经过标准的乙醇/异丙醇沉淀、乙醇洗涤、干燥等操作，获得纯的核酸，溶解于合适的缓冲液中。
3）使用吸附介质的纯化技术：将裂解液过柱，核酸被吸附介质选择性吸附；洗涤去除残留的杂质后，用水或者合适的低盐缓冲液将核酸从介质上洗脱下来，就可以直接用于后续实验。
4) 密度梯度离心法：密度梯度离心也用于核酸的分离和分析。双链DNA、单链DNA、RNA 和蛋白质具有不同的密度，因而可经密度梯度离心形式形成不同密度的纯样品区带，该法适用于大量核酸样本的制备，其中氯化铯2溴化乙锭梯度平衡离心法被认为是纯化大量质粒DNA 的首选方法。氯化铯是核酸密度梯度离心的标准介质,梯度液中的溴化乙锭与核酸结合，离心后形成的核酸区带经紫外灯照射，产生荧光而被检测，用注射针头穿刺回收后，通过透析或乙醇沉淀除去氯化铯而获得纯化的核酸。
（二）纯化方法评价
PC(P是英文酚的缩写，C是英文氯仿的缩写)抽提/醇沉淀方法，是一个永不过时的方法。稳定、可靠、经济、方便。PC抽提可以彻底去除蛋白质，醇沉淀可以去除盐，对于一般的干净的样品 (杂质为蛋白质)，该方法完全可以获得高质量的核酸。虽然每次 PC 抽提都会损失一部分核酸 (因为不可能将水相全部移取)，以及低浓度核酸的醇沉淀效率低，但这些问题都可以靠操作的调整而得以解决或者减少影响。该方法的最大的问题是不适合大规模抽提。PC抽提是去除蛋白质的一个非常有效的手段。苯酚能使蛋白质变性，变性后的蛋白质从水相中被析出，处于苯酚中或者苯酚/水相之间。PC 抽提的关键是，一要混匀彻底，二要用量足够。彻底混匀，才能确保苯酚与蛋白质的充分接触，使蛋白质完全变性。许多人总是担心混匀的剧烈程度是否会对核酸，尤其是基因组 DNA 造成破坏，实际上大可不必如此小心。剧烈的混匀操作，是会部分打断大分子的基因组 DNA，但该破坏作用不会强烈到 DNA 变成 10kb 以内的小片段。手剧烈晃动混匀后，基因组 DNA 的片段，大部分会大于 20kb，这个大小，除了一些特别的要求外，对 PCR 和酶切，都是完全适用的。如果要求的片段非常大，如构建文库用，则不能使用剧烈的混匀方法，而只能来回温和颠倒混匀 – 此时的关键是：裂解液的比例要足够大，使体系不要太粘稠。用量要足够，是因为苯酚去除蛋白质是有一定的饱和度的。超过了该饱和度，裂解体系中的蛋白质不会被一次去除，必须靠多次抽提，方可彻底去除。另外，体系太粘稠的坏处是，蛋白质难以彻底去除，以及基因组 DNA 会断裂得更厉害，所以要注意裂解液与样品的比例。4℃离心操作有利于更彻底去除蛋白质。PC 抽提的另外一个用途是，利用酸性酚可以部分去除 DNA 的特点，在 RNA 抽提时获得 DNA 残留极少的 RNA。不过有一点要提醒的是，有些植物样品，在去除某些杂质之前，是不能使用 PC 抽提的，否则核酸必定降解。
高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方法，同样也是一个非常不错的方法。与 PC 抽提方法相比，除了纯度的稳定性可能要低一点外，该方法几乎克服了 PC 抽提的所有缺点。更快、更轻松去除蛋白质所伴随的好处是，可以用于大规模抽提，不足是纯度 (蛋白质残留) 不够稳定。蛋白质的沉淀效率在 4℃ 会更好一些。
介质纯化方法，是一个越来越受到重视的方法。其最大特点是非常适合大规模核酸抽提，并且因为受人为操作因素影响小，纯度的稳定性很高 (虽然纯度不一定比PC 纯化方法更高)。其致命弱点是样品过量。介质可以分为两大类，一类是柱式的，即介质被预先装填在下面是通的柱子里；另外一类则是颗粒状 (如Glassmilk、磁性小珠等)。颗粒状的介质的纯化操作与经典的醇沉淀差别不大，都是通过数次的加液-倒液过程，干燥后，溶解即可获得纯化好的核酸。柱式纯化的操作虽然也是有加液-倒液过程，但因为加入的液体通过离心后会进入另外一个离心管中，与含有核酸的柱子完全是分开的，所以洗涤更彻底，操作更省力 (不用操心将核酸倒掉了，或者液体的残留)。不过，介质纯化方法的成本是最高的。
（三）醇的沉淀
1）沉淀的原理目的：目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来，从而实现核酸与其它杂质–主要是盐的分离。就核酸而言，标准的醇沉淀要求有一定的盐及某一比例的醇用量，但这决不是说这些盐是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。实际操作中不难发现，当裂解体系中核酸的浓度达到一定水平后，即使体系中不含教科书中建议的盐，单独使用醇也可以使核酸沉淀下来；或者含有盐，使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下来 (当然，得率可能会降低)。知道这一点的意义在于：不要迷信标准方法的唯一性；相反，当使用标准方法碰到问题 – 主要是纯度问题时，完全可以通过调整沉淀条件来改善。最有参考价值的是的一个沉淀方案：一半异丙醇加一半高盐溶液替代纯粹的异丙醇，可以大大降低多糖残留。另外一个问题就是，要坚信核酸的醇沉淀过程同样也是其它杂质的沉淀过程；调整醇沉淀的条件，虽然会降低核酸的得率，但因为可以大大提高纯度。
2) 沉淀剂的选择：醇沉淀使用异丙醇还是乙醇，我们并没有发现这二者对质量有大的影响。异丙醇沉淀的核酸比较紧凑，帖壁紧，颜色不是很白；乙醇沉淀的核酸比较蓬松，容易从壁上移动，颜色比较白。这是现象，少量核酸用异丙醇沉淀，大量核酸用乙醇沉淀。至于异丙醇沉淀更容易沉淀下盐的说法，我们没有碰到过，我更觉得出现该现象的原因就在洗涤的不彻底。当然，也不要忘记异丙醇沉淀的最大优点是体积小，可以使绝大部分的小量抽提操作在 1.5ml 离心管内完成。但由于其沉淀物很紧凑，洗涤时其中心部分不容易被洗涤到，所以，洗涤异丙醇沉淀的核酸的关键是：一定要使沉淀悬浮起来，一定要放置一段时间使沉淀最终变成蓬松的白色。如果再洗涤一次，质量决不会有问题的。当然，沉淀所用的试剂，不仅仅就乙醇和异丙醇，还有包括PEG、LiCl、CTAB 都可以用于核酸沉淀，虽然它们远没有醇沉淀的高使用频率，但却各有特点。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA，CTAB 可以从含多糖的裂解体系中将核酸沉淀下来。PEG 是沉淀病毒颗粒的方便手段。 3) 沉淀温度的选择：如果核酸抽提的起始样品是杂质比较多时，原则上不要使用低温沉淀。低温沉淀能提高沉淀效率：当核酸浓度很低时，效果明显；当核酸浓度比较高时，效果不明显，但却会导致杂质的大大增加。
（四）核酸的洗涤
洗涤原理与目的：洗涤对于整个提取过程来说，也是非常重要的。洗涤，首先一定要将沉淀悬浮起来；第二就是要控制一定的时间，尤其是当核酸沉淀比较大时 (使核酸沉淀最终蓬松；第三是少量多次；第四则是去上清要彻底。大部分资料中的操作基本上都是“倒掉上清后倒置在吸水纸上片刻”，这一说法，对于质量好的离心管，如果离心管是经过硅化的，因为液体几乎不挂壁，所以上清可以去除得非常彻底；好的管子，即使没有经过硅化，残留量也非常少，也没有什么问题；差的管子，液体的挂壁非常可观，其残留量多到会影响后续的实验。避免液体残余的一个好方法，就是倒掉液体后再短暂离心，将残液用移液器吸出。还有需大家牢记的是，残液中都含有上一步操作中的杂质，其残留量与混匀程度、核酸沉淀的大小都有关。挥发时去掉的是乙醇，杂质是不会被挥发去除的。这步，切忌不要用手甩，这样容易将核酸甩掉。另外，核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也决定了洗涤的强度。沉淀越大，裂解液的裂解能力越强，洗涤越要彻底：放置时间相对要长一点，洗涤次数也要考虑增加。当然，乙醇浓度的选择也非常重要，一般情况，洗涤一定要用室温的 75% 乙醇。
（六）核酸的浓缩
应用最广的核酸浓缩法是乙醇沉淀法。在中等浓度单价阳离子存在下，加入一定量的乙醇后，所形成有核酸沉淀可经离心而回收，甚至对低至pg量的DNA或RNA，也可定量回收。回收的核酸可按所需浓度，再溶于适当的缓冲液中。
核酸浓缩的具体操作时，可向含样品的小离心管中加入V/10单价阳离子盐贮存液2V无水乙醇，混匀，放冰水浴中15～30min，取出目测平衡，0～4度，12000g，离心10min。吸弃上清，再另70%乙醇0.5～1ml，12000g，0～4度洗涤离心2min。吸弃上清，沉淀用油泵抽干或打开盖子晾干后，溶于适当体积的缓冲液中。单价阳离子盐的选择，主要基于下述考虑：用醋酸铵可减少dNTP的共沉淀，但在以后要作核酸的磷酸化时应避免用醋酸铵，因铵离子是T，多核苷酸激酶的强烈抑制剂。当用较高浓度的乙醇沉淀RNA时，常用LiCl，因LiCl在乙醇中溶解度很高，不随核酸共沉淀。含有SDS的核酸样品，应使用NaCl，这时该去垢剂要70%乙醇中仍保持可溶。DNA和RNA沉淀，大多使用醋酸钠（pH5.2 ）。
六、核酸质量的检测问题
将抽提好的核酸直接用于后续的实验，是唯一可靠的检测方法；除此之外的检测方法，都是相对的，而且并不十分可信。目前用于正式实验前检测核酸质量的方法，一是电泳，二是紫外分光光度仪。电泳检测的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大 (超出电泳分离范围)，该方法还是非常可信的；电泳还可以用于估计核酸的浓度，但其准确度与经验有关；另外，电泳也可能提供某些杂质污染的信息，但是同样与经验有关。紫外分光光度仪检测的是纯度和核酸含量，然而，由于紫外分光光度仪不能确保非常准确，而该仪器的灵敏度又非常高，所以，提供的结果并不十分可信。一般讲，同时进行紫外和电泳检测，综合二者的结果，可以做出一个更合理的判断。但由于 这两个方法都有缺陷，所以，即使出现坏的结果能用于后续实验而好的结果却不能用于后续实验，也不用大惊小怪。
关于紫外分光光度仪的检测。首先，不要使用不能选择波长的仪器；使用那些已经固定了波长的仪器，大概可以算是你梦魇的开始 (没有信息是可怕的，更可怕的是将错误的信息当真，其中280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。)。其次，一定要经常调较仪器；最后，要记住读数 A230 ：A260 ：A280 = 1：2 (DNA 为 1.8) ：1 为理论上的数据，实际测定时会有一些差别；但如果差别太大，就有问题了，有两个值得商榷的观点：如果 A260/A230 > 2 就是纯的，如果 A260/A280 > 2 就是核酸降解。A260/A230 如果比 2.0 大许多，一定是有杂质残留的 (具体是什么杂质我不知道)。如果核酸抽提好后立即就测定，A260/A280 > 2.0 决不提示核酸降解，原因是：那些能导致 A260/A280 > 2.0 的核酸片段非常小，常规的沉淀是不可能将它们沉淀下来的；更可能的原因是：你仪器提供的 A260/A280 实际是 A262/A282 甚至 A264/A284 的值。纯的核酸的吸光值，在 A230 是谷底，在 A260 是峰顶，在 A280 则正好是半山坡。根据曲线在底和顶的斜率最小，在半山坡的斜率最大的特点，不难得出如下结论：A230 和 A260 的读数受仪器准确性的影响比较小，而 A280 受仪器准确性的影响比较大。关于电泳检测，观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。
建议先电泳检测，再用紫外分光光度仪检测。电泳后，可以看到哪些样品根本就不能用 (如降解太厉害)，以及核酸的大致浓度，这样就为紫外分光光度仪的检测提供了一个参考 (降解的不必要测了，要测的该取多少量等)。
七、核酸中杂质的去除
对于一些对核酸纯度要求较高的实验，我们就需要对其进行特殊的处理，除去其中的多糖、蛋白质及非目的核酸，其方法如下：
（1）肝糖元、淀粉及粘多糖，由于其物理化学性质与核酸有许多相似之处，常在提取液中残存下来。除去的方法常有：①取材前尽量减少组织中多糖的含量，如先使动物饥饿数天然后杀死，可使细胞内肝糖元大大减少。②加入淀粉酶，将大分子多糖分解为小分子，在以后纯化步骤中逐渐被除去。③在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下层水相，核酸在上面有机层中。④以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA，使之与多糖分离。
（2）蛋白质的除去：由于核酸在细胞内以核蛋白体形式存在，不论采用哪种方法提取核酸，蛋白质都不同程度地存在于体系中。因此，除去蛋白质是核酸分离纯化不可避免的步骤。常用方法有下列几种：①加入去污剂如硫酸十二脂钠，从提取到分离纯化各阶段均可反复使用此法。去污剂与氯仿法或苯酚法结合使用，效果更加理想。②氯仿-戊醇或辛醇对提取液摇荡抽提，蛋白质在氯仿-水界面形成凝胶，离心后除去，核酸留在水溶液中。此法在分离纯化中也常反复使用。③苯酚水溶液抽提，在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，DNA或RNA都可以进入水相，蛋白质则沉淀于酚层，然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA或DNA，残余的酚可用葡聚糖凝胶G-10或G-25除去。
核苷酸单体聚合而成的生物大分子，是生物细胞最基本和最重要的成分。一般认为，生物进化即始于核酸，因为在所有生命物质中只有核酸能够自我复制。今天已知核酸是生物遗传信息的贮藏所和传递者。一种生物的蓝图就编码在其核酸分子中。核酸是1869年米歇尔(F. Miescher)在脓液的白细胞中发现的。他当时称之为核素。阿尔特曼(R. Altmann)于1889年认识其酸性后，定名为核酸。
二、核酸的分类和功能
核酸分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两大类。这两类核酸有某些共同的结构特点，但生物功能不同。
DNA贮存遗传信息，在细胞分裂过程中复制，使每个子细胞接受与母细胞结构和信息含量相同的DNA；RNA主要在蛋白质合成中起作用，负责将DNA的遗传信息转变成特定蛋白质的氨基酸序列。
核酸的基本结构单元是核苷酸，核苷酸含有含氮碱基、戊糖和磷酸3种组分。碱基与戊糖构成核苷，核苷的磷酸酯为核苷酸。DNA和RNA中的戊糖不同，RNA中的戊糖是D-核糖；DNA不含核糖而含D-2-脱氧核糖(核糖中2位碳原子上的羟基为氢所取代)。核酸就是根据其中戊糖种类来分类的，DNA和RNA的碱基也有所不同。
三、核酸的理化性质
RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离核酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L，DNA钠盐在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA。
四、细胞裂解
（一）裂解原理在核酸提取过程中，细胞裂解是非常重要的。
经典的裂解液几乎都含有去污剂 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境 (如 Tris)，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏 (如 EDTA)、维持核酸结构的稳定 (如 NaCl) 等。去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶，利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 裂解的，该方法已经成为了 RNA 抽提的主流，却不是基因组 DNA 抽提的主流。
（二）细胞的裂解方法
细菌细胞破碎方法有以下几种：
1）机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法。关于超声波处理法，要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间。
2）化学试剂法：用含SDS或CTAB的溶液处理细胞，在一定的pH环境和变性条件下,细胞破裂,蛋白质变性沉淀,核酸被释放到水相，pH环境则由加入的强碱(NaOH)或缓冲液( TE、STE等)提供，表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀,缓冲液中的一些金属离子螯合剂( EDTA等)可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子Mg2+ 、Ca2+ ,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。
3）反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。个人经验一般情况，37℃,3min，液氮3min,反复三次即可以。
4）酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶、蛋白酶K等，都可使细胞壁破碎，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质,促进核酸的分离。其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-(1 ,4) 键水解。蛋白酶K能催化水解多种多肽键,其在65 ℃及有EDTA、尿素(1～4mol/ L) 和去污剂(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X-100) 存在时仍保留酶活性,这有利于提高对高分子量核酸的提取效率。在实际工作中,酶作用、机械作用、化学作用经常联合使用。具体选择哪种或哪几种方法可根据细胞类型、待分离的核酸类型及后续实验目的来确定。
（三）裂解方法的评价
含蛋白酶的裂解方法，可以认为是抽提基因组 DNA 的首选。裂解包括膜蛋白的游离和与基因组 DNA 相连接的蛋白质的游离。蛋白酶的作用是使蛋白质变小，故而对蛋白质的游离有巨大的促进作用；同时，巨大的基因组DNA 是很容易“缠”住大分子的东西的，蛋白质被蛋白酶消化变小后，则不容易被基因组 DNA “缠”住，有利于蛋白质在纯化操作中的去除，使最终获得的基因组 DNA 的纯度更高。另外一个思路是，如果基因组 DNA 与蛋白质 “缠”在一起，在纯化的过程中有两种可能：如果基因组 DNA 的特性占优势，则纯化时以 DNA 的形式被保留下来，导致蛋白质的残留；如果蛋白质的特性占优势，则纯化时以蛋白质的形式被去除，导致 DNA 的损失。当然去污剂裂解方法，仍然在细胞基因组 DNA 抽提方面有优势，尤其是当得率和纯度要求不是最高，而经济性及操作简单很重要时。控制好裂解液/样品的比例是该方法成功的关键。该方法结合高盐沉淀，可以实现最简单的操作，但纯度及得率的稳定性可能会比用PC抽提的差一些。
高浓度蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 的裂解方法，是抽提 RNA 的首选。总 RNA 的抽提，最重要的是快速裂解细胞膜，至于与基因组 DNA 相连接的蛋白质的裂解以及基因组与蛋白质 “缠”住的问题，因为都不会对以后的纯化产生大的影响，可以不考虑。高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜，进而迅速抑制住细胞内的 RNA 酶，从而确保了 RNA 的完整性。除了极少量不适用该方法的样品 – 主要是植物，其它绝大部分样品的 RNA 的抽提，都可以以高浓度的蛋白质变性剂为基础的。当然有些样品，如肌肉，即使是 RNA 抽提，也强烈建议使用含蛋白酶的裂解液 (或者在操作中的某个时候使用蛋白酶消化蛋白质) ，原因在于这些样品中的蛋白质，是非常难以去除的。该方法是获得最大得率和最高纯度的基础。
含 CTAB 的裂解液，几乎成为富含多糖的样品，如细菌、植物的基因组 DNA 抽提的首选裂解方法。该方法成功与否与两个因素有关：一是CTAB 的质量，二是洗涤的彻底程度。CTAB 的质量对裂解效率有很大的影响，而且，似乎还说不清楚原因，因为即使是同一公司生产的纯度一样的 CTAB，批号不同，效果就可能差别很大。洗涤去除 CTAB 要比其它的盐难一些，同时，CTAB 的少量残留也会对酶活性有巨大影响，所以洗涤是否彻底也是该方法成功与否的关键。裂解时的温度，多使用 65℃；但如果发现降解严重或者得率太低，可以试一下 37℃ – 45℃这个相对低温的区域。
SDS 碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法，具有快速、得率高、几乎无基因组 DNA 污染的特点。控制好裂解液/菌体的比例和操作的温和是该方法成功的关键。蛋白质的沉淀效率在4℃会更好一些，所以，加入溶液 III 后在 4℃静置一段时间以及采用 4℃离心去蛋白质，都可以提高质量。该方法不一定要使用 PC 纯化，但结合 PC 纯化，可以获得纯度很高的质粒。RNA 的去除可以靠在溶液 I 中加入 RNase A (100ug/ml) 或者在最后的溶解液中加入 RNase A (25 ug/ml) 来实现。总的感觉是，在溶液 I 中使用 RNase A，RNA 的残留少一些。不过，经典沉淀几乎没有办法彻底去除 RNA 残留。另外，对大质粒 (50 kb 以上)，该方法可能会有问题。
PCR 模板的简易裂解方法，也是使用面很广的一类方法。该方法的特点是无须纯化，样品被裂解后即可直接取裂解液用于 PCR，非常快速。也正因为不纯化，所以，假阴性 (即没有扩增出来的阳性) 比例也比较高。该方法最简单的就是反复冻融法，简便快捷，不需任何化学试剂，冻融离心，PCR检测就可以了。如果使用裂解法，最简单的裂解液就是水，复杂一点的就会含有一些不会抑制后续的 PCR 反应，而且能提高裂解效率，甚至还可能部分消除样品内抑制 PCR 反应杂质的东西，如 Triton X-100、甲酰胺等。再复杂一点的就会含有诸如 Chelex 100 之类的能吸附部分杂质的介质。操作也非常简单，多使用温度的变化来实现样品的裂解，如煮沸、或者高温-低温的多次循环等。该方法最适合从一大堆样品中找出阳性样品，但却不适合用于判断某一个样品是阳性还是阴性。降低样品使用量可以提高阳性率，因为样品量的降低，同时意味着 PCR 的抑制物量的降低。
裂解液的用量原则是：确保能彻底裂解样品，同时使裂解体系中核酸的浓度适中。浓度过低，将导致沉淀效率低，影响得率；浓度过高，去除杂质的过程复杂且不彻底，导致纯度下降。另外，裂解液的用量是以样品中蛋白质的含量为基准的，而不是以核酸含量为基准，这一点务必牢记。
五、核酸纯化
就个人所知，目前在科研领域广泛使用的核酸纯化技术主要可以分为两大类：使用介质的和不使用介质的，使用介质的，一次就将核酸与其它所有杂质分开；不使用介质的，一定是首先将核酸和盐与大分子杂质分开，再通过沉淀核酸使核酸与盐分开 (PEG 沉淀和 LiCl 沉淀除外)。
1）经典的使用苯酚/氯仿抽提的纯化技术：细胞裂解后离心分离含核酸的水相，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25 ∶24 ∶1 体积) 混合液。依据应用目的，两相经漩涡振荡混匀(适用于分离小分子量核酸) 或简单颠倒混匀(适用于分离高分子量核酸) 后离心分离。疏水性的蛋白质被分配至有机相，核酸则被留于上层水相。酚是一种有机溶剂，预先要用STE 缓冲液饱和，因未饱和的酚会吸收水相而带走一部分核酸。酚也易氧化发黄,而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联；故在制备酚饱和液时要加入一特殊物质，以防止酚氧化。氯仿可去除脂肪，使更多蛋白质变性,从而提高提取效率。异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。核酸盐可被一些有机溶剂沉淀,通过沉淀可浓缩核酸,改变核酸溶解缓冲液的种类以及去除某些杂质分子。典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀，在含核酸的水相中加入p H5. 0～5.5 ，终浓度为0.3M的NaAc 或KAc 后，钠离子会中和核酸磷酸骨架上的负电荷，在酸性环境中促进核酸的疏水复性。然后加入2～2. 5 倍体积的乙醇,经一定时间的孵育，可使核酸有效地沉淀。其他的一些有机溶剂（异丙醇、聚乙二醇( PEG) 等）和盐类(10. 0mol/ L 醋酸铵、8. 0mol/ L 的氯化锂、氯化镁和低浓度的氯化锌等) 也用于核酸的沉淀。
2）使用离子交换介质的纯化技术：将裂解液过柱，核酸被联结在离子交换介质上；洗涤去除残留的杂质后，用高盐缓冲液将核酸从介质上洗脱下来。再经过标准的乙醇/异丙醇沉淀、乙醇洗涤、干燥等操作，获得纯的核酸，溶解于合适的缓冲液中。
3）使用吸附介质的纯化技术：将裂解液过柱，核酸被吸附介质选择性吸附；洗涤去除残留的杂质后，用水或者合适的低盐缓冲液将核酸从介质上洗脱下来，就可以直接用于后续实验。
4) 密度梯度离心法：密度梯度离心也用于核酸的分离和分析。双链DNA、单链DNA、RNA 和蛋白质具有不同的密度，因而可经密度梯度离心形式形成不同密度的纯样品区带，该法适用于大量核酸样本的制备，其中氯化铯2溴化乙锭梯度平衡离心法被认为是纯化大量质粒DNA 的首选方法。氯化铯是核酸密度梯度离心的标准介质,梯度液中的溴化乙锭与核酸结合，离心后形成的核酸区带经紫外灯照射，产生荧光而被检测，用注射针头穿刺回收后，通过透析或乙醇沉淀除去氯化铯而获得纯化的核酸。
（二）纯化方法评价
PC(P是英文酚的缩写，C是英文氯仿的缩写)抽提/醇沉淀方法，是一个永不过时的方法。稳定、可靠、经济、方便。PC抽提可以彻底去除蛋白质，醇沉淀可以去除盐，对于一般的干净的样品 (杂质为蛋白质)，该方法完全可以获得高质量的核酸。虽然每次 PC 抽提都会损失一部分核酸 (因为不可能将水相全部移取)，以及低浓度核酸的醇沉淀效率低，但这些问题都可以靠操作的调整而得以解决或者减少影响。该方法的最大的问题是不适合大规模抽提。PC抽提是去除蛋白质的一个非常有效的手段。苯酚能使蛋白质变性，变性后的蛋白质从水相中被析出，处于苯酚中或者苯酚/水相之间。PC 抽提的关键是，一要混匀彻底，二要用量足够。彻底混匀，才能确保苯酚与蛋白质的充分接触，使蛋白质完全变性。许多人总是担心混匀的剧烈程度是否会对核酸，尤其是基因组 DNA 造成破坏，实际上大可不必如此小心。剧烈的混匀操作，是会部分打断大分子的基因组 DNA，但该破坏作用不会强烈到 DNA 变成 10kb 以内的小片段。手剧烈晃动混匀后，基因组 DNA 的片段，大部分会大于 20kb，这个大小，除了一些特别的要求外，对 PCR 和酶切，都是完全适用的。如果要求的片段非常大，如构建文库用，则不能使用剧烈的混匀方法，而只能来回温和颠倒混匀 – 此时的关键是：裂解液的比例要足够大，使体系不要太粘稠。用量要足够，是因为苯酚去除蛋白质是有一定的饱和度的。超过了该饱和度，裂解体系中的蛋白质不会被一次去除，必须靠多次抽提，方可彻底去除。另外，体系太粘稠的坏处是，蛋白质难以彻底去除，以及基因组 DNA 会断裂得更厉害，所以要注意裂解液与样品的比例。4℃离心操作有利于更彻底去除蛋白质。PC 抽提的另外一个用途是，利用酸性酚可以部分去除 DNA 的特点，在 RNA 抽提时获得 DNA 残留极少的 RNA。不过有一点要提醒的是，有些植物样品，在去除某些杂质之前，是不能使用 PC 抽提的，否则核酸必定降解。
高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方法，同样也是一个非常不错的方法。与 PC 抽提方法相比，除了纯度的稳定性可能要低一点外，该方法几乎克服了 PC 抽提的所有缺点。更快、更轻松去除蛋白质所伴随的好处是，可以用于大规模抽提，不足是纯度 (蛋白质残留) 不够稳定。蛋白质的沉淀效率在 4℃ 会更好一些。
介质纯化方法，是一个越来越受到重视的方法。其最大特点是非常适合大规模核酸抽提，并且因为受人为操作因素影响小，纯度的稳定性很高 (虽然纯度不一定比PC 纯化方法更高)。其致命弱点是样品过量。介质可以分为两大类，一类是柱式的，即介质被预先装填在下面是通的柱子里；另外一类则是颗粒状 (如Glassmilk、磁性小珠等)。颗粒状的介质的纯化操作与经典的醇沉淀差别不大，都是通过数次的加液-倒液过程，干燥后，溶解即可获得纯化好的核酸。柱式纯化的操作虽然也是有加液-倒液过程，但因为加入的液体通过离心后会进入另外一个离心管中，与含有核酸的柱子完全是分开的，所以洗涤更彻底，操作更省力 (不用操心将核酸倒掉了，或者液体的残留)。不过，介质纯化方法的成本是最高的。
（三）醇的沉淀
1）沉淀的原理目的：目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来，从而实现核酸与其它杂质–主要是盐的分离。就核酸而言，标准的醇沉淀要求有一定的盐及某一比例的醇用量，但这决不是说这些盐是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。实际操作中不难发现，当裂解体系中核酸的浓度达到一定水平后，即使体系中不含教科书中建议的盐，单独使用醇也可以使核酸沉淀下来；或者含有盐，使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下来 (当然，得率可能会降低)。知道这一点的意义在于：不要迷信标准方法的唯一性；相反，当使用标准方法碰到问题 – 主要是纯度问题时，完全可以通过调整沉淀条件来改善。最有参考价值的是的一个沉淀方案：一半异丙醇加一半高盐溶液替代纯粹的异丙醇，可以大大降低多糖残留。另外一个问题就是，要坚信核酸的醇沉淀过程同样也是其它杂质的沉淀过程；调整醇沉淀的条件，虽然会降低核酸的得率，但因为可以大大提高纯度。
2) 沉淀剂的选择：醇沉淀使用异丙醇还是乙醇，我们并没有发现这二者对质量有大的影响。异丙醇沉淀的核酸比较紧凑，帖壁紧，颜色不是很白；乙醇沉淀的核酸比较蓬松，容易从壁上移动，颜色比较白。这是现象，少量核酸用异丙醇沉淀，大量核酸用乙醇沉淀。至于异丙醇沉淀更容易沉淀下盐的说法，我们没有碰到过，我更觉得出现该现象的原因就在洗涤的不彻底。当然，也不要忘记异丙醇沉淀的最大优点是体积小，可以使绝大部分的小量抽提操作在 1.5ml 离心管内完成。但由于其沉淀物很紧凑，洗涤时其中心部分不容易被洗涤到，所以，洗涤异丙醇沉淀的核酸的关键是：一定要使沉淀悬浮起来，一定要放置一段时间使沉淀最终变成蓬松的白色。如果再洗涤一次，质量决不会有问题的。当然，沉淀所用的试剂，不仅仅就乙醇和异丙醇，还有包括PEG、LiCl、CTAB 都可以用于核酸沉淀，虽然它们远没有醇沉淀的高使用频率，但却各有特点。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA，CTAB 可以从含多糖的裂解体系中将核酸沉淀下来。PEG 是沉淀病毒颗粒的方便手段。 3) 沉淀温度的选择：如果核酸抽提的起始样品是杂质比较多时，原则上不要使用低温沉淀。低温沉淀能提高沉淀效率：当核酸浓度很低时，效果明显；当核酸浓度比较高时，效果不明显，但却会导致杂质的大大增加。
（四）核酸的洗涤
洗涤原理与目的：洗涤对于整个提取过程来说，也是非常重要的。洗涤，首先一定要将沉淀悬浮起来；第二就是要控制一定的时间，尤其是当核酸沉淀比较大时 (使核酸沉淀最终蓬松；第三是少量多次；第四则是去上清要彻底。大部分资料中的操作基本上都是“倒掉上清后倒置在吸水纸上片刻”，这一说法，对于质量好的离心管，如果离心管是经过硅化的，因为液体几乎不挂壁，所以上清可以去除得非常彻底；好的管子，即使没有经过硅化，残留量也非常少，也没有什么问题；差的管子，液体的挂壁非常可观，其残留量多到会影响后续的实验。避免液体残余的一个好方法，就是倒掉液体后再短暂离心，将残液用移液器吸出。还有需大家牢记的是，残液中都含有上一步操作中的杂质，其残留量与混匀程度、核酸沉淀的大小都有关。挥发时去掉的是乙醇，杂质是不会被挥发去除的。这步，切忌不要用手甩，这样容易将核酸甩掉。另外，核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也决定了洗涤的强度。沉淀越大，裂解液的裂解能力越强，洗涤越要彻底：放置时间相对要长一点，洗涤次数也要考虑增加。当然，乙醇浓度的选择也非常重要，一般情况，洗涤一定要用室温的 75% 乙醇。
（五）核酸的溶解和保存
1）核酸溶解：纯化后的核酸，其中 RNA 以水溶解为主，DNA 则多以弱碱性的 Tris 或者 TE 溶解。经典的 DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解，其中原因是有人认为 EDTA 可以减少 DNA 被可能残留下来的 DNase 降解的风险；如果操作过程控制得当，DNase 的残留几乎是可以忽略的，完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA。
2）核酸保存：基本上，核酸在保存中的稳定性，与温度成反比，与浓度成正比。一般的我们选择，-20℃或-70℃保存的稳定。如果温度不合适，保存中核酸发生降解或者消失，首要原因是酶残留导致的酶解，第二个原因则是保存核酸溶液的 pH 值不合适导致的水解(RNA 在弱酸性更稳定，而 DNA 在弱碱性更合适。还有一个不为人重视的，就是EP 管对核酸的影响。首先一定要坚信一点，那就是核酸一定会与装它的容器的接触面发生反应，达到某种均衡。EP 管的材质，首先可能吸附核酸，其次还可以诱导核酸的结构发生某些变化，如变性。在核酸的浓度比较高时，这个现象可能观察不到；当核酸浓度很低时，则比较明显了。在低浓度的核酸中加入 Geletin,Glycogen,BSA 可以稳定核酸，虽然已经为实验所证明，但许多实验人员并没有将该建议当回事。现在制造 EP 管的材料远多于过去。这些新出现的材料，在强度、透明度等物理特征方面可能比原来的纯 PP 材质要好许多，但其化学特征，尤其是对核酸稳定性的可能影响，远没有研究透彻。正如现在的质粒可以改造得越来越适用某些要求一样，其负面产物可能是，抽提的质粒电泳的构型越来越多：除了原来的三种带型外，还可能出现 denatured cc 、multimeric forms of cc 等等带型。（六）核酸的浓缩
应用最广的核酸浓缩法是乙醇沉淀法。在中等浓度单价阳离子存在下，加入一定量的乙醇后，所形成有核酸沉淀可经离心而回收，甚至对低至pg量的DNA或RNA，也可定量回收。回收的核酸可按所需浓度，再溶于适当的缓冲液中。
核酸浓缩的具体操作时，可向含样品的小离心管中加入V/10单价阳离子盐贮存液2V无水乙醇，混匀，放冰水浴中15～30min，取出目测平衡，0～4度，12000g，离心10min。吸弃上清，再另70%乙醇0.5～1ml，12000g，0～4度洗涤离心2min。吸弃上清，沉淀用油泵抽干或打开盖子晾干后，溶于适当体积的缓冲液中。单价阳离子盐的选择，主要基于下述考虑：用醋酸铵可减少dNTP的共沉淀，但在以后要作核酸的磷酸化时应避免用醋酸铵，因铵离子是T，多核苷酸激酶的强烈抑制剂。当用较高浓度的乙醇沉淀RNA时，常用LiCl，因LiCl在乙醇中溶解度很高，不随核酸共沉淀。含有SDS的核酸样品，应使用NaCl，这时该去垢剂要70%乙醇中仍保持可溶。DNA和RNA沉淀，大多使用醋酸钠（pH5.2 ）。
六、核酸质量的检测问题
将抽提好的核酸直接用于后续的实验，是唯一可靠的检测方法；除此之外的检测方法，都是相对的，而且并不十分可信。目前用于正式实验前检测核酸质量的方法，一是电泳，二是紫外分光光度仪。电泳检测的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大 (超出电泳分离范围)，该方法还是非常可信的；电泳还可以用于估计核酸的浓度，但其准确度与经验有关；另外，电泳也可能提供某些杂质污染的信息，但是同样与经验有关。紫外分光光度仪检测的是纯度和核酸含量，然而，由于紫外分光光度仪不能确保非常准确，而该仪器的灵敏度又非常高，所以，提供的结果并不十分可信。一般讲，同时进行紫外和电泳检测，综合二者的结果，可以做出一个更合理的判断。但由于 这两个方法都有缺陷，所以，即使出现坏的结果能用于后续实验而好的结果却不能用于后续实验，也不用大惊小怪。
关于紫外分光光度仪的检测。首先，不要使用不能选择波长的仪器；使用那些已经固定了波长的仪器，大概可以算是你梦魇的开始 (没有信息是可怕的，更可怕的是将错误的信息当真，其中280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。)。其次，一定要经常调较仪器；最后，要记住读数 A230 ：A260 ：A280 = 1：2 (DNA 为 1.8) ：1 为理论上的数据，实际测定时会有一些差别；但如果差别太大，就有问题了，有两个值得商榷的观点：如果 A260/A230 > 2 就是纯的，如果 A260/A280 > 2 就是核酸降解。A260/A230 如果比 2.0 大许多，一定是有杂质残留的 (具体是什么杂质我不知道)。如果核酸抽提好后立即就测定，A260/A280 > 2.0 决不提示核酸降解，原因是：那些能导致 A260/A280 > 2.0 的核酸片段非常小，常规的沉淀是不可能将它们沉淀下来的；更可能的原因是：你仪器提供的 A260/A280 实际是 A262/A282 甚至 A264/A284 的值。纯的核酸的吸光值，在 A230 是谷底，在 A260 是峰顶，在 A280 则正好是半山坡。根据曲线在底和顶的斜率最小，在半山坡的斜率最大的特点，不难得出如下结论：A230 和 A260 的读数受仪器准确性的影响比较小，而 A280 受仪器准确性的影响比较大。关于电泳检测，观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。
建议先电泳检测，再用紫外分光光度仪检测。电泳后，可以看到哪些样品根本就不能用 (如降解太厉害)，以及核酸的大致浓度，这样就为紫外分光光度仪的检测提供了一个参考 (降解的不必要测了，要测的该取多少量等)。
七、核酸中杂质的去除
对于一些对核酸纯度要求较高的实验，我们就需要对其进行特殊的处理，除去其中的多糖、蛋白质及非目的核酸，其方法如下：
（1）肝糖元、淀粉及粘多糖，由于其物理化学性质与核酸有许多相似之处，常在提取液中残存下来。除去的方法常有：①取材前尽量减少组织中多糖的含量，如先使动物饥饿数天然后杀死，可使细胞内肝糖元大大减少。②加入淀粉酶，将大分子多糖分解为小分子，在以后纯化步骤中逐渐被除去。③在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下层水相，核酸在上面有机层中。④以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA，使之与多糖分离。
（2）蛋白质的除去：由于核酸在细胞内以核蛋白体形式存在，不论采用哪种方法提取核酸，蛋白质都不同程度地存在于体系中。因此，除去蛋白质是核酸分离纯化不可避免的步骤。常用方法有下列几种：①加入去污剂如硫酸十二脂钠，从提取到分离纯化各阶段均可反复使用此法。去污剂与氯仿法或苯酚法结合使用，效果更加理想。②氯仿-戊醇或辛醇对提取液摇荡抽提，蛋白质在氯仿-水界面形成凝胶，离心后除去，核酸留在水溶液中。此法在分离纯化中也常反复使用。③苯酚水溶液抽提，在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，DNA或RNA都可以进入水相，蛋白质则沉淀于酚层，然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA或DNA，残余的酚可用葡聚糖凝胶G-10或G-25除去。
（3）不同类型核酸的分离：两种类型核酸的制备过程中，DNA制品中混杂着少量RNA或RNA制品中混杂着少量DNA是经常发生的。由于DNA和RNA结构和性质都很相似，而且分子量都十分大，所以两类核酸的分离是核酸纯化工作中比较复杂和繁琐的一步。
从DNA中除去RNA的方法常有：①核糖核酸酸酶选择地破坏RNA，这是比较有效的方法，但使用的核糖核酸酶中常含有极微量的脱氧核糖核酸酶，必须事先加热处理除去，然后将纯净的核糖核酸酶与样品溶液一起在37℃孵育数分钟，就可达到破坏RNA的目的。②钙盐分步沉淀：在核酸溶液中加入1/10体积10%的氯化钙溶液，使DNA与RNA均成为钙盐后，再利用DNA钙盐在2/10体积乙醇中能形成沉淀析出，RNA钙盐不形成沉淀而彼此分离。③活性炭吸附：将处理好的活性炭按1/15～1/20体积加入每毫升含有0。5～1mgDNA溶液中，0～4。C下搅拌1h ，以31000×g离心1h，除去RNA后的DNA回收率可达94%。
在RNA制品中除去DNA，苯酚水溶液抽提是较有效和常用的方法。在没有阴离子化合物存在下，以等体积90%苯酚水溶液反复抽提RNA，可以除去绝大部分DNA。此外，也可采用加入脱氧核糖核酸酶处理，破坏DNA，或参考上述DNA与RNA分离方法将DNA除去。（4）同类核酸的分离：①RNA混合物的分离：经过提取的初步纯化的RNA制品中含有各类RNA和某些已降解的RNA混杂物。进一步纯化时，多应用柱层析、梯度离心及逆流分溶等方法。例如tRNA与rRNA的分离用吸附于硅藻土表面的甲基化白蛋白柱吸附后，以不同梯度氯化钠溶液洗脱，或用蔗糖梯度（顶部5%浓度，底部20%浓度）离心法分开。mRNA的代谢速度较快，在细菌中平均寿命为90min，在哺乳动物中约为几小时至十几小时，常用密度梯度离心法和DNA-琼脂柱进行分离。制备rRNA时，由于共沉作用，常混有mRNA，一般可用萘-1，5-二磺酸处理，使二者分开。各种tRNA的提纯，通常采用逆流分溶法在磷酸缓冲液-甲酰胺-异丙醇系统下进行，分离效果较好。②DNA混合物的分离：主要是变性或降解的DNA和天然的分离，常用磷酸钙、ECTEOLA-纤维素、DEAE-纤维素和甲基化白蛋白柱层析，逆流分溶，梯度离心等方法。一个具有生物活性高度提纯的DNA制品应具有如下标准：不含有蛋白质及多糖；不含有可透析的小分子杂物；在pH7时紫外吸收最大值在257～261μm之间，E（P）在6600左右；不含有RNA；固体为纤维状，水溶液具有高的粘度并有流动双折射作用；具有电泳均一性及超离心中单分散性；具有生物活性。
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