链霉亲和素磁珠(SA magnetic bead)产品性能比较研究
磁性聚合物微球兼具高分子微球特性和磁响应性,因此,广泛应用于靶向给药、生物诊断、催化剂制备、磁成像等领域。目前,大部分的生物分子是通过表面的氨基或者羧基与磁性微球表面的基团共价结合的方式直接固定化在磁性微球的表面。这种方法不仅复杂,还会使固定化的生物分子活性受到较大影响,例如抗体可能会失去与抗原的特异性结合的能力。同时,会限制磁性微球的应用范围。
生物分子很容易被生物素共价附着修饰,且被附着的生物分子在活性上上几乎没有损失。活化的生物素可以与已知的几乎所有生物分子偶联,包括蛋白质,核酸,多糖,脂类等。目前很多市售的生物分子,例如抗体,酶,蛋白质,核酸等均被生物素修饰。修饰了生物素的生物分子,可以被固定化链霉亲和素的磁性微球直接吸附,一个链霉亲和素分子能结合4个生物素分子,因此可以实现多级放大效应,且链霉亲和素与生物素之间的亲和作用,是目前已知强度最高的非共价作用,其结合稳定,不受离子强度,酸碱性等不良环境的影响,同时方法简单,应用范围更加广泛。
链霉亲和素磁性微球能快速捕捉反应液中生物素修饰的分子,在抗体和核酸偶联应用中具有快速简单的独特优势,是生物诊断中最常用的亲和捕获磁珠。市场上的链霉亲和素磁珠产品质量良莠不齐,不同厂家产品在测定其游离生物素结合能力时所采用方法的差异使不同产品难以比较。
本文采用荧光生物素的方法测定了市场主流进口链霉亲和素磁性微球产品结合游离生物素能力。
磁性微球对生物素亲和检测的机理如图所示。
分别取200 μL、400 μL、600 μL、800 μL、1200 μL、1600 μL、2000 μL、3000 μL、4000 μL、6000 μL、8000 μL、10000 μL的SA磁性微球(0.1 mg/mL)加入到2 mL离心管中,磁分离,加入100 μL的50 mM的pH 8的三乙醇胺缓冲液。加入1 mL的1 μM的荧光生物素(BF)溶液,避光,室温下震荡30 min。磁分离,取1 mL上清,用荧光分光光度计测量荧光,其激发波长为494 nm,发射波长为520 nm。对生物素吸附量的由公式(1)与公式(2)求得:
BF_b=(1-(sample fl.)/(blank fl.))× BF0 (1)
W=(BFb×1 mL)/(0.1 mg) (2)
式中sample fl.和blank fl.分别为样品的荧光值和空白对照的荧光值;BF0与BFb分别为初始与磁性微球消耗的荧光生物素的浓度,单位为μM;W为磁性微球对荧光生物素的吸附量,单位pmol/mg。
经检测后结果,如下图所示:
由图可知,PuriMag和Bangs的链霉亲和素磁珠检测的结果明显高于其它同类产品,其中PuriMag的链霉亲和素磁珠约是Dynal的5倍,表现优异。Sphero、Dynal、Scipac、Cortex的产品性能相近。分析该结果,其主要原因可能是各家产品表面包覆的链霉亲和素有显著差异,此外各家磁珠的尺寸不同,亦会导致这种差异。PuriMag的磁珠为直径200nm,其比表面积显著大于直径1um或2.8um的磁珠。由于尺寸较小,PuriMag的磁珠悬浮性亦明显由于其它产品。
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