第三节        质粒DNA的提取与纯化

大多数质粒都是双链的共价闭合环状质粒（CCC plasmid）DNA，简称闭环质粒（closed circular plasmid，CC plasmid）。作为携带外源基因在细菌中扩增或表达的重要载体（vector），质粒在基因工程中应用十分广泛。有关质粒的提取与纯化是必须掌握的基本技术。

一、提取与纯化的方法

质粒DNA的提取与纯化的方法很多，经典的方法包括碱裂解法、煮沸裂解法、SDS裂解法等。这些方法主要由细菌的培养（质粒DNA的扩增）、细菌的裂解（质粒DNA的释放）及质粒DNA的分离与纯化等三个步骤组成。按制备量的不同，质粒DNA提取与纯化的方法可分为质粒DNA的小量（1ml～2ml）制备、质粒DNA的中量（20ml～50ml）制备及质粒DNA的大量（500ml）制备。

（一）碱裂解法

碱裂解法简单、重复性好而且成本低，是使用最广泛的方法。在NaOH提供的高pH（12.0～12.6）条件下，用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性，释放出质粒DNA。尽管碱液能破坏核酸的碱基配对，但CCC质粒DNA因缠结紧密而不会解链。只要不在碱性条件下变性太久，当pH调至中性时，CCC质粒DNA就可重新恢复其天然状态。裂解后，细胞壁碎片与变性的蛋白质和染色体DNA形成大的复合物，这些复合物在高钾盐条件下，可有效沉淀，而质粒DNA保留于上清中。直接通过无水乙醇沉淀质粒DNA，并用70%的乙醇洗涤，其纯度可满足DNA测序与PCR等实验的要求。

碱裂解法是一种适用范围很广的方法，能从所有的大肠杆菌（E.coli）菌株中分离出质粒DNA，制备量可大可小。

（二）煮沸裂解法

煮沸裂解法是将细菌悬浮于含Triton X-100和溶菌酶的缓冲液中，Triton X-100和溶菌酶破坏细胞壁后，沸水浴裂解细胞的同时可破坏DNA链的碱基配对，并使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA变性，但CCC质粒DNA因结构紧密不会解链。当温度下降后，CCC质粒DNA可重新恢复其超螺旋结构。通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA，然后回收上清中的质粒DNA。

煮沸裂解法是一种条件比较剧烈的方法，对于大质粒（>15kb）有明显的剪切作用，故只能用于小质粒DNA（<15kb）的制备。该法能用于小质粒DNA的小量与大量制备，并且适用于大多数的E.coli菌株。由于糖类很难去除，而且糖抑制限制性酶和聚合酶的活性，故该法不适用于在去污剂、溶菌酶和加热情况下可释放大量糖类的E.coli菌株，如HB101及其衍生菌株（TG1）。另外，煮沸不能完全灭活核酸内切酶A（endonuclease A，endA）的活性，故表达endA的菌株亦不适用于本法。在细菌培养过程中，加入氯霉素可抑制细菌的蛋白合成和细菌分裂，有利于质粒DNA的选择性扩增。

（三）SDS裂解法

大于15kb的质粒DNA容易因细胞裂解和后继操作而遭到破坏，因此需要温和的裂解方法。SDS裂解法是将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，去壁细菌再用SDS裂解，从而温和地释放质粒DNA到等渗液中，然后用酚/氯仿抽提。

由于条件温和，SDS裂解法有利于大质粒DNA的提取。但该法在处理过程中，有一部分质粒DNA因缠结在细胞碎片上而丢失，故产率不高。

（四）其它方法

其它方法如小量一步提取法、牙签少量制备法及Triton-溶菌酶法等，各有特点与适用范围。小量一步提取法，直接将酚/氯仿与细菌培养物混合，同时完成细胞裂解与蛋白质变性两个过程，然后离心去除大部分胞核DNA与蛋白质，最后从上清中回收质粒DNA。该法简单快速、经济可行，可用于内切酶图谱分析。

（五）质粒DNA的纯化

目前，关于纯化的方法与方案非常多，都利用了质粒相对较小和共价闭环的结构特点。其中，纯化效果好而且适用范围广的方法主要有氯化铯-溴化乙锭等密度梯度超速离心法（简称CsCl-EB法）、聚乙二醇沉淀法和柱层析法。

1．CsCl-EB法  CsCl-EB法是一种沉降平衡离心法，经超速离心，离心介质CsCl形成一连续的密度梯度，在过量EB存在的条件下，各种不同密度的物质经离心平衡后得以分开。其中蛋白质密度小（1.3 g/cm³～1.4g/cm³），浮于液面；RNA密度大（2.0g/cm³），沉于管底；各种DNA密度介于蛋白质与RNA之间，处于中部。过量EB处理前，细菌染色体DNA与不同分子构型的质粒DNA的密度均为1.7g/cm³左右，难以区分。经过量EB处理后，不同分子构型的DNA与EB的结合能力不一样，因而密度下降不一致，可有效分离。其中，闭环质粒DNA为超螺旋三级结构，EB不易插入，结合量少，密度下降小，约为1.59 g/cm³；而染色体DNA、开环质粒DNA以及带切口的环状质粒DNA可以嵌入更多的EB，密度下降较多，约为1.54 g/cm³，从而能与闭环质粒DNA分开。回收的闭环质粒DNA含有嵌入的EB，可采用有机溶剂抽提法或离子交换层析加以去除。经典的CsCl-EB法由于其容量大、分辨率高、纯化效果好，至今仍是质粒DNA纯化的标准方法。但该法很费时并需要昂贵的设备与试剂。

2．聚乙二醇沉淀法  聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）沉淀法是一种分级沉淀法。质粒DNA的粗制品首先用LiCl沉淀大分子RNA，并用RNase消化小分子RNA；然后在高盐条件下，用PEG选择性地沉淀大的质粒DNA；沉淀的质粒DNA进一步用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。该法简单、经济、适用广，尤其对碱裂解法提取的质粒纯化效果好，适用于分子克隆中所有常规的酶学反应，也能用于高效的哺乳动物细胞的转染。但PEG法不能有效分离带切口的环状质粒DNA与闭环质粒DNA。

3．柱层析法  柱层析法纯化质粒DNA的关键是其填充的树脂。大体上，树脂可分为两类：一类是利用疏水的相互作用来纯化质粒DNA样品；一类则通过离子交换与吸附的相互作用进行纯化。以硅基质作为填充材料的柱层析，其作用原理是在多盐条件下，依靠DNA与硅基质的可逆性结合来进行纯化。多盐造成磷酸二酯骨架的脱水，通过暴露的磷酸盐残基，DNA吸附到硅基质上，以50%的乙醇溶液洗去RNA和糖类等生物大分子，然后加入TE或水溶液使DNA分子重新水合，并通过离心洗脱出来。DNA与硅基质的吸附作用与DNA的碱基组成和拓扑结构无关，因此可用于环型质粒DNA和线性DNA的纯化。小于100bp～200bp的DNA分子由于与硅基质的吸附力很弱，不能用于小分子DNA片段的纯化。但在纯化大分子DNA时，可有效去除小分子DNA的污染。

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