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货号
规格
MS-TIM001
1 ml
MS-TIM010
10 ml
1. 产品描述
MagStart-IMAC-Ti（使用钛离子作为固定化金属亲和层析）是一种专有的磁性聚合物微球载体，提供简单、方便、高效的磷酸肽富集方法，例如胰蛋白酶消化的蛋白质混合物。该产品利用聚合物技术的卓越特性，将钛离子（Ti4+）螯合到聚合物微球MagStart上，设计了一种高度特异性富集磷酸肽的产品，适用于基于质谱的蛋白质组学应用。与MagReSyn®-Ti-IMAC有等同效果。
MagStart-IMAC-Ti微粒极高的官能团密度为生物分子偶联提供了高浓度的反应位点。MagStart-IMAC-Ti的高结合载量允许减少高活性功能微粒的体积来实现实验方案小型化，进而最大限度地减少所需试剂的体积，从而允许以更小的体积应用固定化配体。MagStart可快速磁分离（<10 秒），通过磁压缩减少了洗涤和洗脱过程中颗粒间隙，从而提高了效率和回收率，强磁性还可防止微粒的意外丢弃而避免样品损失。
Product Specifications
Description
Iron oxide-containing magnetic polymer microspheres
Application
Isolation and purification of phosphopeptides
Matrix
Proprietary polymer
Core
Iron (II, III) oxide (Magnetite)
Functional group
Ti4+
Particle Size
~5–10 μm
Formulation
20 mg/ml suspension in 20% ethanol
Stability
pH 2.5~12, 4~60 ℃
Storage
Store at 4–8⁰C until expiry date on label DO NOT FREEZE
注意：不当储存、微粒干燥、细菌污染或离心回收可能导致容量/性能的不可逆损失。使用前应充分混匀。
2. 结合和洗脱流程
可能影响磷酸肽结合的因素包括缓冲液组成和pH值，以及DNA或其他干扰化合物等污染物的存在。超声处理可能不足以降解 DNA，建议在裂解物中降解 DNA（e.g. Benzonase®）。我们建议在富集前对样品进行脱盐，以去除干扰化合物，例如使用Waters Sep-Pak C18或Oasis HLB滤芯。所需的磁珠数量可能需要根据您的应用进行优化，主要是多肽：磁珠比例，以确保最佳回收率和特异性。
注意：所有试剂都应是新鲜制备的分析级，以确保最佳性能。下面描述的程序、方法和缓冲溶液仅供参考，无意限制。MagStart-IMAC-Ti 与一系列不同的磷酸肽富集缓冲液兼容。可实现的纯度和产量取决于实验条件，应针对每个特定应用进行优化。
2.1. MagStart-IMAC-Ti的平衡
MagStart-IMAC-Ti 以 20 mg/ml悬浮于20% 乙醇中形式提供，使用前需要去除运输溶液，并在结合缓冲液中平衡微粒。每个反应需要至少20μl磁珠悬浮液以确保手动吸取和自动化方案中的磁珠沉淀的量。目前的方案足以从~500μg总蛋白消化物中纯化磷酸肽。可通过对当前协议进行以下调整来适应起始蛋白：
Protein Digest
Bead Quantity
Ratio of Beads/Peptide
Equilibration volume (μl)
Wash volume (μl)
20 μg
20μl: 0.4mg
20
200
100
50 μg
8
100 μg
4
200 μg
40μl: 0.8mg
500 μg
100μl: 2mg
1 mg
200μl: 4mg
2 mg
400μl: 8mg
400
注意：虽然这是推荐的方案，但富集可能取决于样品。例如：对于磷酸肽丰度低的样品，您可以降低微珠与蛋白质的比率（即，将 1 mg 微珠用于 500 μg 蛋白质，蛋白质：微珠比例为 1：2）。理想的比率应该是基于样品经验性的。
1） 通过涡旋混合或倒置彻底重悬 MagStart-IMAC-Ti，以确保磁珠均匀的悬浮。
2） 将100 μl 的MagStart-IMAC-Ti（2 mg 珠子，蛋白与珠子比例为1：4）转移到2 ml离心管中。
3） 将离心管置于磁力架上10秒至磁分离澄清。
4） 移除上清运输保存液。
5） 加入200 μl Loading Buffer （0.1 M glycolic acid in 80% ACN, 5%TFA），平衡60秒。
注意：调节glycolic acid浓度对富集结合容量、特异性和选择性（如单磷酸化多肽和多磷酸化多肽）有影响。在进行大规模富集效率研究前，建议根据样本来源和纯度评估glycolic acid浓度范围，以获得最优结果。
6） 将离心管置于磁力架上10秒至磁分离澄清，并移除Loading Buffer。
7） 重复步骤5和6两次，共进行三次平衡。
8） 移除Loading Buffer后，MagStart-IMAC-Ti可直接用于目标磷酸肽的结合。
2.2. 磷酸化多肽富集流程
1） 将500 μg脱盐蛋白在200 μl Loading buffer中酶解和混匀。
2） 4℃下10000×g离心5分钟移除不溶物。
3） 将上清液转移到2.1步骤准备好的MagStart-IMAC-Ti磁珠中。
4） 涡旋或移液枪上下吹打混匀磁珠。
5） 在室温孵育20分钟确保磁珠样本充分互作。
6） 将离心管置于磁力架上10秒至磁分离澄清，并移除上清液。
7） 加入100 μl的Loading buffer轻轻搅动2分钟，以洗去未结合的的样本。
8） 将离心管置于磁力架上10秒至磁分离澄清，并移除上清液。
9） 加入100 μl的Wash buffer 1 （80% ACN和1% TFA水溶液）轻微吹打2分钟，重选洗去非特异性结合的多肽。
10） 将离心管置于磁力架上10秒至磁分离澄清，并移除上清液。
11） 加入100 μl Wash buffer 2 （10% ACN和0.2% TFA水溶液）再轻微吹打2分钟洗涤磁珠。
12） 加入150 μl Elution buffer（1% NH4OH）持续轻微混匀10分钟，洗脱磁珠结合的磷酸多肽。
13） 将离心管置于磁力架上10秒至磁分离澄清。
14） 将含磷酸多肽的洗脱上清液转移到低蛋白吸附的离心管中（含50μl的10% Formic Acid）。
15） 重复12-14步骤以提高回收率。
16） 将所有洗脱液合并成得400 μl。
17） 冻干或真空干燥洗脱液（-80℃处理30分钟）。
18） 质谱分析样品。分析前可通过C18 SPE柱除盐或在线C18除盐浓缩后进行液质分析。
2.3. 推荐缓冲液
Loading buffer: 0.1 M glycolic acid in 80% acetonitrile (ACN), 5% trifluoroacetic acid (TFA)
Wash buffer 1: 80% ACN, 1% TFA
Wash buffer 2: 10% ACN, 0.2% TFA
Elution buffer: 1% NH4OH
3. 常见问题
问题
可能原因
改善方法
配体未按预期与微粒结合
反应时间不够
延长孵育时间到30分钟
样品或溶液中的干扰物阻止结合
DNAse酶和脱盐处理以移除潜在的干扰物
微粒数量不足
增加颗粒的数量
非特异性结合多肽
磷酸化多肽结合竞争不足
增加结合液中glycolic acid浓度或降低磁珠/蛋白比例
洗涤体积不够
增加洗涤液体积到高至500μl
洗涤时间不够
增加洗涤时间
尝试替换洗涤液
Wash buffer 1: 60% ACN, 1% TFA, 200mM NaCl；
Wash buffer 2: 60% ACN, 1% TFA
低磷酸化多肽回收
尝试替换洗脱液
确认NH4OH浓度为1%。增加到4%，并加入CAN至终浓度为40%。
对样本重新使用磁珠
将2.2中步骤6的上清保留并重新与磁珠孵育。
浓缩倍数不够
质谱前冻干浓缩样品。
低于预期质谱信号
脱盐。降低洗脱时间。
TMT标签应用中低回收
与样本或试剂不相容
请参考产品引用
客户发表论文：
1. Gongzhen Liu, et al. Proteomics and phosphoproteomics reveal novel proteins involved in Cipangopaludina chinensis carcasses. Front. Chem., 29 August 2024, Sec. Analytical Chemistry, Volume 12 - 2024 | https://doi.org/10.3389/fchem.2024.1416942 (TiO2磁珠和IMAC-Ti磁珠用于磷酸化蛋白质组学分析)
