货号
产品名称
包装
PMG-TagAb002-1mL
PuriMag™ Rabbit IgG Magnetic Beads （兔IgG磁珠）
1mL×1
PMG-TagAb002-5mL
1mL×5
保存条件： 4ºC保存，两年有效。长期不使用，可以-20ºC保存，-20ºC可以保存更长时间。
一．产品简介
² PuriMag™ Rabbit IgG Magnetic Beads，即兔IgG磁珠，也称兔IgG免疫磁珠、Rabbit Normal IgG Magnetic beads，是由高品质的正常兔IgG与纳米磁珠共价偶联而成，通常用作免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）、免疫共沉淀（Co-IP）、染色质免疫沉淀（Chromatin immunoprecipitation, ChIP）等抗体相关实验时兔来源抗体磁珠的对照IgG磁珠。
² 本兔IgG磁珠中的兔IgG为正常的兔IgG（Normal Rabbit IgG），是一种未经任何标记的非特异性IgG。
² 本兔IgG磁珠作为对照磁珠时，可排除IgG本身和特定目的蛋白或其它特定生物分子的非特异性结合。
² 与国内外大多数的同类产品相比，本产品不易产生非特异吸附。每毫升磁珠悬液含~10mg磁珠，结合~0.5mg兔IgG抗体，该磁珠基本不会识别任何抗原。参考正常抗体免疫磁珠的用量。
二．主要技术指标
Product content
10mg/ml magnetic beads in specific protective buffer
Beads size
~200nm
Magnetization
Superparamagnetic
Coupled antibody
Normal Rabbit monoclonal antibody
Isotype
Rabbit IgG
M.W. of antibody
Approximately 150kDa
Antibody concentration
≥0.5mg Rabbit IgG per ml beads
Binding capacity
None
Specificity
Elution method
Elution with acid, competing peptide or SDS‐PAGE loading buffer
Application
IP, Co-IP, Protein purification
三．注意事项
l 本产品经测试，反复冻融3次以上，不影响使用效果。
l 本产品需维持pH为6-8，避免高速离心和干燥；请勿长时间置磁珠于磁场中，否则可能会引起磁珠聚团。
l 本产品使用前要适当充分重悬，混匀操作须轻柔，不宜剧烈涡旋震荡等，避免抗体变性等。
l 在免疫沉淀或纯化时，建议设置阳性和阴性对照组。
l 蛋白样品收集后宜尽快完成纯化工作，并应始终放置在4ºC或冰浴，以减缓蛋白降解或变性。为有效抑制蛋白降解，可以在蛋白样品中添加适量的蛋白酶抑制剂混合物。
l 如果使用真空泵等仪器吸取上清液，须注意真空泵的吸液强度，以免吸力过大而吸取到聚集的磁珠。
l 酸性溶液洗脱时磁珠可能会发生聚集，属于正常现象，不影响磁珠的正常使用。0.1%的非离子型去垢剂（如Triton X-100、Tween-20或NP-40）可有效防止磁珠聚集，并且不会影响磁珠的抗体结合效率。
l 高浓度的DTT、巯基乙醇、盐酸胍等对本产品与标签蛋白的结合可能有一定影响，但Western及IP细胞裂解液、RIPA裂解液或NP-40裂解液等都完全适用。
l 本产品仅限于专业人员科研使用。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
四．使用说明
1. 样品的制备
a. 选择合适的裂解液，用于制备细胞或组织的裂解液。需要确保裂解液的pH为6-8。
b. 具体的细胞或组织样品裂解的制备步骤请参考裂解液的使用说明。制备好的裂解液上清宜置于冰上或4ºC存放，随后即可用于免疫沉淀或免疫共沉淀、标签蛋白的纯化等操作。新制备的样品，建议尽量当天完成免疫沉淀等后续操作，如样品不能当天使用，也可适当分装后-80ºC冻存。
2. 兔IgG磁珠的准备
由于兔IgG磁珠储存在特殊保护液中，所以需要在加入样品前适当洗涤。
a. 用移液器轻轻吹打重悬兔IgG磁珠，按照每500μl样品10μl或20μl磁珠悬浊液，取适量兔IgG磁珠至一洁净离心管中，加入1×TBS至最终体积为约0.5ml。
b. 用移液器轻轻吹打重悬兔IgG磁珠。磁分离，去除上清。重复上述步骤两次，因为保存液中有甘油也可适当增加洗涤次数或者加大洗涤液体积。
c. 按照初始体积的量，用1×TBS重悬兔IgG磁珠。
3. 免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）
a. 加入磁珠与孵育。按照每500μl蛋白样品加入10μl或20μl磁珠悬浊液的比例加入兔IgG磁珠，置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育2小时或4ºC孵育过夜。注：孵育过程中，如果磁珠发生聚团或呈片状属正常现象，不会影响实验结果。
b. 磁分离。孵育完毕后，磁分离，去除上清。注：可保留部分上清液，用于检测免疫沉淀的效果。
c. 洗涤。加入500μl的1×TBS，用移液器轻轻吹打重悬兔IgG磁珠。磁分离，去除上清。重复洗涤三次。注：也可通过检测洗涤上清液的OD280来判断是否洗涤完全，若OD280>0.05，应适当增加洗涤次数。
4. 洗脱
根据标签蛋白的特点及后续实验要求，可以选择如下3种方法之一进行洗脱。以下以Anti-Flag磁珠为例，Anti-Flag磁珠采用一种方式洗脱时，兔IgG磁珠作为阴性对照，需要使用相同的洗脱方式。
a. 3×Flag竞争洗脱：本法为非变性法，洗脱效率高，且洗脱后蛋白保持原有生物活性，便于后续分析检测。
(a) 3×Flag多肽洗脱液的配制：取适量3×Flag多肽(P9801)溶解于1×TBS中，使其终浓度为150μg/ml，或稀释5mg/ml的3×Flag多肽溶液至150μg/ml。
(b) 每10-20μl原始磁珠体积，加入100μl 3×Flag多肽洗脱液（150μg/ml），混匀后置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温摇晃孵育30~60分钟，或4ºC孵育1~2小时。为了提高洗脱效率，可延长孵育时间或重复洗脱。
(c) 孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，将上清转移到新的离心管中。上清即为洗脱的Flag标签蛋白。
(d) 洗脱的Flag标签蛋白置于4ºC待用，或者-20ºC或-80ºC长期保存。
b. 酸性洗脱：本法为非变性法，比较快速且高效。洗脱后的蛋白保持原有的生物活性，便于后续分析检测。
(a) 溶液的配制：酸性洗脱液（0.1M Glycine-HCl, pH3.0），中和液（0.5M Tris-HCl, pH7.4, 1.5M NaCl）。
(b) 每10-20μl原始磁珠体积，加入100μl酸性洗脱液，混匀后置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育5分钟。注：孵育时间不宜超过15分钟。
(c) 孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，将上清转移到新的离心管中，并立刻加入10μl中和液，适当混匀。
(d) 为了获得最大的洗脱效率，可重复步骤b和c，并将相同样品合并。
(e) 洗脱并中和的Flag标签蛋白置于4ºC待用，或者-20ºC或-80ºC长期保存。
注1：酸性洗脱法虽然高效，但仍可能低于竞争洗脱法或SDS-PAGE上样缓冲液洗脱法。
注2：由于目的蛋白的差异可能对酸性洗脱法的洗脱效率有一定的影响，如果对洗脱效率的要求比较高，可对酸性洗脱液的pH在2.5-3.1之间进行一定的调整，相应的中和液的pH值或量也要进行一定的调整，例如100μl酸性洗脱液（0.1M Glycine-HCl, pH2.8）和15μl中和液（1M Tris-HCl, pH8.5）。
c. SDS-PAGE上样缓冲液洗脱：本法为变性洗脱法，得到的蛋白样品适合SDS-PAGE电泳或WB检测。
(a) SDS-PAGE上样缓冲液的配制：参考《分子克隆》等配制5×或2×的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，然后加入水配制成1×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。通常SDS-PAGE蛋白上样缓冲液含有DTT等还原剂，其洗脱得到的蛋白样品中会含有Flag抗体的轻链和重链。
(b) 每10~20μl原始磁珠体积的磁珠，加入100μl 1×SDS-PAGE上样缓冲液，95ºC加热5分钟。
(c) 置于磁力架上分离10秒，取上清进行SDS-PAGE电泳或Western检测。
