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货号
规格
MS-HYX001
1 ml
MS-HYX010
10 ml
1. 产品描述
MagStart-Hydroxyl，是由超多孔聚合物网络组成的磁性聚合物微载体，由羟基封端的磁珠组成。亲水表面和中性官能团减少了非特异性相互作用，提高需要在珠消化应用的肽的回收率。与MagReSyn®-HYDROXYL效果等同。
MagStart微球技术的进步使生物分子可在整个微粒空间渗透和结合，为生物分子的结合提供了极高的结合能力。MagStart微粒极高的官能团密度为生物分子提供了高密度的结合位点。MagStart的高结合载量允许减少高活性功能微粒的体积来实现实验方案小型化，进而最大限度地减少所需试剂的体积，从而允许以更小的体积应用固定化配体。MagStart可快速磁分离（<10 秒），通过磁压缩减少了洗涤和洗脱过程中颗粒间隙，从而提高了效率和回收率，强磁性还可防止微粒的意外丢弃而避免样品损失。
Product Specifications
Description
Iron oxide-containing magnetic polymer microspheres
Application
Immobilization of proteins, peptides, enzymes, antibodies and other ligands
Matrix
Proprietary polymer
Core
Iron (II, III) oxide (Magnetite)
Functional group
Hydroxyl group (-OH)
Binding capacity
≥20 mg/ml (BSA)
Particle Size
~5–10 μm
Formulation
20 mg/ml suspension in 20% ethanol
Stability
pH 3.5~10, 4~60 ℃
Storage
Store at 4–8⁰C until expiry date on label DO NOT FREEZE
注意：不当储存、微粒干燥、细菌污染或离心回收可能导致容量/性能的不可逆损失。使用前应充分混匀。
2. PAC流程
Protein Aggregation Capture (PAC)
该方案用于在 1.5ml的 Eppendorf Protein LoBind® 管或 96 孔板形式中捕获珠上蛋白质聚集，适用于任何标准磁力架。蛋白质提取可以在生物缓冲液（如Tris或PBS）中使用SDS进行，典型范围为细胞的1%SDS到组织的4%SDS。为了最大限度地提高回收率，需要对样品进行超声处理和/或基于酶的核酸降解（using benzonase）。还建议在PAC之前按照标准方案进行半胱氨酸残基的减少和烷基化（即TCEP和CAA）。
该方案针对没有盐酸胍或尿素作为提取剂的裂解物进行了优化。尽管这些是相容的，但必须将样品中的这些试剂稀释至<3M。
由于改进了处理、快速分离和改善了磁架上的保留，该方案目前使用磁珠，特别是来自PuriMag的MagStart-Hydroxyl羟基磁珠。磁珠的使用还确保了该协议可以转化为自动化样品制备。
1） 建议 PAC 的蛋白质与微珠比例为 1：4（重量：重量），即对于 20μg 蛋白质，使用 100μg （5μl） 微粒。将所需的 MagStart-Hydroxyl羟基微粒（20mg/ml悬浮液）转移到 1.5ml 低蛋白吸附的离心管或 96 孔板中。
• 注意：如有必要，可以调整蛋白质与微球的比例，特别是对于浓度低于 0.1 μg/μl的方案兼容性，您将需要大约 3 倍的微球（即蛋白质：微球比例为 1：15）以提高回收率。
2） 将试管或板放在磁力架上，让微粒从溶液中分离（5-10 秒）。
3）取出储存溶液（20%乙醇）并丢弃。
4）通过加入100μl的70%乙腈来平衡微粒，并通过轻轻搅拌混合（足以使颗粒保持悬浮状态）。
5）将离心管放在磁力架上，让微粒分离。（适用于手动、涡旋、热混合器或智能混合器）。
6） 取出洗涤缓冲液并丢弃。
7） 重复步骤 4 和 5，总共两次平衡。
8） 将蛋白质提取物（缓冲至 pH 值>8）添加到平衡的微粒中。
9）将乙腈加入含有微粒和生物提取物的试管中，至终浓度为70%，并用移液管混合一次，制成均匀的悬浮液。
• 大体积（例如 >500μl）的样品可以在 1.5ml Eppendorf 管中分成较小的体积，也可以在较大的容器中进行聚集，例如 15 或 50 ml 离心管。
• 注意：我们观察到，在较大的试管中使用乙腈进行蛋白质聚集会导致蛋白质聚集体积聚在管壁上。如果用消解溶液覆盖管壁上的聚集，则其本身并不是问题。
10） 珠子上应在 10 分钟内发生沉淀，不得有任何搅拌。
11） 将试管/板放在磁架上，磁分离 5-10 秒。
12）用移液管抽吸除去上清液并丢弃。
• 注意：确保不要干扰分离的微珠-蛋白质聚集体。可以保留上清液用于SDS-PAGE分析，以检查任何未结合的蛋白质（检查捕获效率）。
13）向试管中加入 1 ml 100% 乙腈并孵育 10 秒
• 注意：在洗涤过程中，重要的是将洗涤液轻轻添加到试管中，而不会干扰微珠蛋白聚集体/沉淀。避免将洗涤缓冲液直接移液到磁分离的微珠蛋白聚集体上。洗涤次数可增加到 3 次，以提高纯度。
14）向离心管加1 ml 的70% 乙醇并孵育 10 秒。
• 注意事项：70-90% 甲醇或异丙醇也可用作洗涤溶剂，以去除蛋白质样品中的潜在污染物。如有必要，也可以重复此步骤，以提高纯度。在添加酶解缓冲液之前，确保完全去除洗涤溶剂，以免干扰胰蛋白酶解。
15）从磁性架上取下试管/板，向试管中加入消化缓冲液（50mM HEPES、TEAB、碳酸氢铵或 Tris，pH 8.5）并充分混合以形成均匀的悬浮液。
• 注意：确保沿管壁的任何残留珠子都浸没在消化缓冲液中。粘附在管壁上的干燥珠子可以通过吸头手动置换，直到浸没在消化缓冲液中。
16）（可选）以 1：200（蛋白酶与蛋白质）比例加入 Lys-C，并在 37°C 下间歇混合孵育1-2 小时。
17） 以 1：50（蛋白酶与蛋白质）的比例加入胰蛋白酶，并在 37°C 下间歇混合孵育过夜（12-16 小时）。
• 注意：可以根据需要调整比率以增加或减少。通过使用较低的 LysC 和胰蛋白酶比例（例如 1：20）并在较高温度（例如 50°C）下消化，也可以将酶解时间缩短至 1-3 小时。
18） 淬火消解，将溶液酸化至最终TFA浓度为1%。
• 注意：这可以通过添加 10% TFA 储备溶液来实现，以减少对纯 TFA 溶液的处理。
19）将样品混合并放置在磁架上的试管/板中 60 秒，然后将上清液转移到新离心管中。
20）用 50-100 μl的 1% TFA 洗涤珠子 2 分钟，连续混合。将洗脱的蛋白转移到新离心管。
21）混合19）和20）获得的蛋白。
22） 以最大微量离心机速度（最大速度通常为 16,000 – 20,000 g）离心10 分钟。
23） 将上清液和透明肽上清液转移到新管，使用疏水性（例如 C18）或亲水性（例如 HILIC）SPE脱盐。
• 注意：在有预浓缩 LCMS 装置的情况下，可通过在线 C18 捕集柱进行脱盐。
24） 从疏水性SPE洗脱的肽中残留的有机溶剂可以蒸发，并使用speedvac浓缩肽。此时残留的 DNA 或 RNA 可以沉淀，特别是来自未经超声处理和/或酶促 DNA/RNA 降解的组织和某些细胞类型的样品。
• 可选：如果您看到沉淀，请将重悬样品以 16,000 – 20,000 g 离心 10 分钟。
25）将上清液转移到新管中，并通过LC/MS/MS进行分析。
参考文献：
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