1. 产品描述
1.1 产品用途
谷胱甘肽修饰磁珠PuriMag Si-GSH 非常适合用于小型规模的GST标签融合蛋白质纯化。
1.2 原理
把含有GST标签的融合蛋白添加到PuriMag Si-GSH磁珠中，在经过短暂的孵育后，重组蛋白将被吸附到磁珠上，然后可使用磁珠分离架把GST融合蛋白洗脱下来。磁分离技术消除了微管的变化、最大限度地减少样品的损失和消除繁杂传统离心方法的步骤，而且适合于自动化操作。
1.3 材料的描述
PuriMag Si-GSH磁珠是由还原型谷胱甘肽共价结合在的400nm的超顺磁性微球表面组成，表面二氧化硅层可最大限度降低非特异性蛋白的吸附。磁珠储存在含有20%乙醇的PBS（PH=7.4）中，每1mg磁珠能够吸附超过40ug以上的GST标签融合蛋白。
1.4 产品保存
产品能够2-8℃稳定存储，避免冷冻。在存储和所有操作中保证磁珠浸没液体中，干燥的环境会导致吸附量的下降或丧失。使用前应充分悬浮磁珠，避免细菌和真菌污染。
2. 操作流程
该说明书以100 μl的 PuriMag Si-GSH磁珠为例，您可根据需要进行放大或者缩小。
2.1 细胞破碎液和缓冲液准备
从大肠杆菌细胞中制备含有GST标签的重组蛋白，可采用高压匀浆或超声破碎等方法。
过程所需缓冲液：（1）上样Buffer/洗杂Buffer: 1x PBS pH=7.4 （2）洗脱Buffer: 10mM GSH（还原型谷胱甘肽）, 50mM Tris，pH 8.0
2.2 使用前准备
1）充分摇匀磁珠。
2）取100μl磁珠到一个干净的管中。
3）把管放置在磁力架上收集磁珠，去上清液。
4）加入1ml 洗杂/上样Buffer充分混匀后，放置在磁力架上收集磁珠，去上清液。重复该次步骤2次。
2.3 融合蛋白结合
1) 用100μl的上样Buffer/洗杂Buffer重新悬浮磁珠。
2) 加入含有GST标签重组蛋白的样品轻轻混匀。
3) 放置在振荡器或摇床中在室温下孵育30-60min（如果重组蛋白在室温下不稳定，可以再4℃进行）。
4) 把孵育后的小管放置在磁力架上收集磁珠，去上清液。如果有需要可保留上清，另作检测。
5) 加入1ml 洗杂/上样Buffer充分混匀后，放在磁力架上收集磁珠，去上清。重复该次步骤至少3次。
2.4 目的蛋白洗脱
1) 加入100μl洗脱Buffer重新悬浮磁珠，放置在振荡器上室温震荡5min
2) 使用磁力架收集磁珠，把上清转移到另一个干净的管中。
3) 重复步骤1和步骤2.
3. 问题解决方法
问题
可能原因
解决方案
GST融合蛋白产量低或无目的蛋白
融合蛋白是以包涵体表达
降低培养温度，把IPTG的浓度减少到10mM，或者适当减少诱导时间；
将表达的包涵体进行适当的变性和重新折叠。
使用的磁珠太少
增加磁珠使用量。
上样样品太少
增加上样样品量。
融合蛋白没有活性
使用更加温和的破碎方法，如加入溶菌酶破碎细胞，防止目的蛋白变性。
融合蛋白降解
在细胞破碎液和洗杂Buffer中加入适量的PMSF。
融合蛋白不能有效的洗脱下来
增加洗脱时间或者增加洗脱液的浓度到15mM或更高浓度的谷胱甘肽；
调节洗脱液的PH到8.0-9.0；
在洗脱Buffer加入Triton X-100（终浓度0.1%）、Noctylglucoside（终浓度2%）或者NaCl（终浓度0.1-0.2M）。
洗脱液中有多个条带.
融合蛋白被分解
再细胞破碎液和洗杂Buffer中加入适量的PMSF。
一些马的蛋白，如分子伴侣会与GST融合蛋白结合
在洗杂Buffer中加入5mM的DTT。将含有目的蛋白破碎液置于chaperonin Buffer（2MmATP，10mM MgSO4，50mM Tris-HCl）37℃孵育10min，再进行纯化。
超声破碎可能会导致一些蛋白和融合蛋白结合
使用更加温和的破碎条件或者更换破碎方法。
一些蛋白会非特异性结合到融合蛋白或者填料上
优化洗杂条件，加入1% TritonX-100,1% Tween-20,1% CTAB,10mM DTT，0.03% SDS或0.1% NP-40。这些试剂能够帮助去除一些非特异性吸附。
