rev. 19/04/24
Small 1 ml (50 assays)
Large 10 ml (500 assays)
概述： PuriMagTM NTA-Fe磁珠采用固定化金属亲和色谱法捕获磷酸化肽。带负电荷的磷酸基团被磁珠上带正电荷的金属离子吸引。结合液相色谱串联质谱 （LC-MS/MS），该方法使研究人员能够以高度的特异性和灵敏度分离、鉴定和定量大量磷酸化肽，从而全面了解细胞和组织样品中的磷酸化。等效替代High Select™ Fe-NTA Magnetic Phosphopeptide Enrichment Kit。
背景：固定化金属亲和色谱法（IMAC）已被广泛用于通过与负电荷簇结合来富集生物样品中的蛋白质和肽。二价过渡金属离子 Co2+、Cu2+、Ni2+ 和 Zn2+ 常用于纯化富含聚组氨酸或半胱氨酸的蛋白质以及具有金属亲和力的蛋白质。三价金属离子 Fe3+、Ga3+、Al3+ 以及 Ti4+ 和 Zr4+ 通常用于蛋白质组学研究的磷酸肽富集。亚氨基二乙酸 （IDA） 或次氮基三乙酸 （NTA） 用于将金属离子螯合到琼脂糖包被的磁珠。在比较研究中，NTA在选择性捕获和鉴定更多磷酸肽方面比IDA表现更好。Ga3+ 和 Fe3+ 在鉴定的磷酸化肽数量方面具有可比性。与使用 TiO2 的金属氧化物亲和色谱（MOAC）相比，IMAC- Fe3+ 的性能略好，TiO2 偏爱酸性磷酸化肽 （pI > 4），而 Fe3+偏爱酸性较低的肽 （pI < 4）。PuriMagTM NTA-Fe磁珠为磷酸化肽富集提供了一种有效的工具，对磷酸化残基环境几乎没有偏见。它们可以单独使用，也可以与基于免疫亲和力的富集结合使用，以补充任何 LC-MS/MS 蛋白质组学研究。
注意： 对于长期储存，建议用乙腈、甲醇和 0.01% 乙酸的等比例混合物 （1：1：1 v/v/v） 替换 NTA-Fe 磁珠储存缓冲液。制备溶液并使用HPLC级试剂进行洗涤。取出储存缓冲液，用 1 mL 水洗涤珠子 3 次。取出水洗液，向每个测定管中加入 1 mL 长期储存缓冲液。在 4°C 下储存。
储存：PuriMagTM NTA-Fe磁珠以20%乙醇形式提供。对于长期储存，用长期储存缓冲液（1：1：1 v/v/v 甲醇、乙腈和 0.01% 乙酸）代替缓冲液。有关详细信息，请参阅协议。储存在4ºC 下。不要冷冻珠子。
使用说明：在含尿素的缓冲液中裂解细胞，用蛋白酶消化细胞蛋白，通过反相固相萃取纯化所得肽。
然后使用IMAC Beads富集磷酸化肽。通过洗涤除去未结合的肽，并用碱性pH缓冲液洗脱捕获的磷酸化肽。对浓缩富集的肽进行LC-MS/MS分析之前，在微量尖端上进行反相纯化，以脱盐和分离肽与杂质。详细的实验方案如下。
PuriMagTM NTA-Fe磁珠富集流程:
A. 溶液和缓冲液
注意：用HPLC级水制备溶液。三氟乙酸和乙腈应为最高等级（Sequanal）。溶液的所有百分比规格均为体积/体积。
1. 上样缓冲液: (0.1% TFA, 85% acetonitrile) For 5 mL, combine 4.25 mL ACN, 0.725 mL water, and 25 μL 20% TFA.
2. 洗涤缓冲液: (0.1% TFA, 80% acetonitrile) For 50 mL, combine 40 mL ACN, 9.75 mL water, and 250 μL 20% TFA.
3. 洗脱缓冲液: (50% acetonitrile, 2.5% ammonia) For 5 mL, combine 0.45 mL 28% ammonia with 2.05 mL water then add 2.5 mL ACN.
4. 新配 1 M ammonium bicarbonate (AMBIC) stock solution.
5. 配制 5% TFA: adding 50 μL 20% TFA to 150 μL water
B. 流程 (用于胰蛋白酶进行二次消化)
注意：在IMAC富集之前，需要使用测序级胰蛋白酶进行二次消化，以最大程度地减少遗漏的切割位点。
1. 制备测序级胰蛋白酶消化溶液（5% 乙腈、50 mM 碳酸氢铵和 100 ng/uL 胰蛋白酶）。将 33 μL 水与 2.5 μL 1M 碳酸氢铵、2.5 μL 乙腈和 12 μL （5 μg） 胰蛋白酶混合。
2. 在室温下，将 0.5 mg 冻干肽在 1.7 mL 微量离心管中以 2,000 × g 离心 5 分钟，以沉淀管底部的所有材料。用微量移液器移液几次，机械地将沉淀重悬于50μL胰蛋白酶消化溶液中。
注：溶解肽后，在pH试纸上点少量（1-2μL）检查肽溶液的pH值，pH值应接近8.0或不低于6.0。在极少数情况下，pH 值呈酸性较强（由于在次优冻干条件下无法充分去除肽中的 TFA），用未调整 pH 值的 1 M AMBIC 溶液滴定肽溶液。1-2 μL 通常足以中和溶液。
1. 在 37°C 下消化两小时。通过加入 5 μL 5% TFA 终止反应并使溶液酸化。
2. 向消化的肽溶液中加入 0.95 mL 上样缓冲液（0.1% TFA，85% 乙腈）。
3. 在微量离心机中以10,000×g在4°C下离心5分钟，使溶液澄清。不溶性颗粒可能看起来相当大。这不会造成问题，因为大多数肽都是可溶的。
4. 重悬 NTA-Fe 磁珠。使用移液器吸取 20 μL 磁珠并转移到微量离心管中。
5. 用 1 mL 洗涤缓冲液洗涤 PuriMagTM NTA-Fe 磁珠 3 次。磁分离，取出洗涤剂，注意不要去除任何磁珠。
6. 将澄清的肽溶液转移到装有PuriMagTM NTA-Fe 磁珠的离心管中，确保立即混合。
7. 在室温下以最大速度在振荡器上孵育 30 分钟。
8. 磁分离，然后取出上清液，注意不要取出任何磁珠。耗尽的肽溶液可以在-80°C下冷冻并保存以备其他实验使用。
9. 加入 1 mL 洗涤缓冲液洗涤磁珠，移液枪吹打直至珠子完全重悬。磁分离，然后用微量移液器除去上清液。再重复洗涤两次，除去任何剩余的上清液。
10. 加入 50 μL 洗脱缓冲液（50% 乙腈、2.5% 氨水），洗脱磁珠上的磷酸肽。移液枪吹打直至珠子完全重悬，磁分离。
11. 用 0.5 mL 乙腈冲洗新的微量离心管以去除任何污染物，涡旋并丢弃冲洗液。将含有洗脱的磷酸肽的上清液转移到冲洗过的试管中。
12. 加入 40 μL 20% TFA 以酸化洗脱液。
13. 重复洗脱步骤，并将所得洗脱液混合。
14. 在 Speed-Vac 中干燥洗脱的磷酸肽（约 3 小时）。用 40 uL 0.1% TFA 复溶干燥的磷酸肽。
