蛋白质制备 ● 定时 2 小时
1 将 ThermoMixer 预热至 60 °C。
2 在 1.5 mL 试管中以 1 mg/mL 的复溶溶液制备 1 mL BSA 储备溶液。
关键步骤 如果使用需要还原和烷基化但尚未进行还原和烷基化的蛋白质混合物（例如细胞裂解物），请在此处用您的样品代替 BSA 输入并按照说明进行操作。
3 将准备好的BSA原液管在60°C的ThermoMixer中加热30分钟，以1000 r.p.m混合。
4 从热混合器中取出试管，使其在实验室工作台的架子中冷却至室温。
5 向BSA管中加入100μL的 IAA储备液来烷基化还原二硫化物，然后室温避光孵育30分钟。
关键步骤 IAA 对光敏感。溶液应新鲜制备，并在黑暗中进行孵育。
6 向BSA管中加50μL的DTT原液淬灭烷基化反应，然后室温孵育15分钟。
暂停点 制备的样品（本例中为BSA）可以无限期地储存在-80°C下。
SP3 蛋白纯化和消化 ● 定时 30 分钟 + 18 小时孵育
7 将 ThermoMixer 预冷至 24 °C。
8 在复溶溶液中将制备的10 μg（10 μL 制备的1 mg/mL 原液）BSA稀释至最终体积48 μL。
9 加入100 μg的SP3磁珠并移液混匀。这是2 μL（50μg/μL SP3）磁珠原液，终体积为 50 μL 蛋白质溶液。
关键步骤 确保溶液中SP3磁珠完全均质化。轻柔移液吹打混合。混合不当会降低SP3的蛋白质回收效率。
10 为诱导蛋白质与珠子结合，向含SP3珠子的BSA混合物中加入50 μL乙醇。短暂摇晃试管以均质化。
关键步骤 避免加入乙醇后过度摇晃混合物，尽量减少磁珠粘附在管上部而造成的损失。通过初始混合步骤完全均质化并非必需；水相和乙醇相部分整合就足够了。在下一步孵育中，将使用混匀仪完全混合。
11 将结合混合物在24°C的ThermoMixer中以1,000 r.p.m孵育5分钟。
关键步骤 避免以>1000 r.p.m.的速度混合。快速混合会导致聚集的磁珠粘附管壁，可能降低蛋白回收率。
关键步骤 观察孵育后磁珠的聚集。微珠的聚集表明蛋白质在微珠表面结合。聚集量与输入材料的数量成正比，并取决于结合条件（例如，反应体积和珠子数量）。
12 结合完成后，将试管放入磁力架中并孵育，直到珠子迁移到管壁上。
关键步骤 观察被磁架吸引时管壁上珠子的结合模式。珠子在内管壁周围分布是结合材料的良好指示。非常细的珠子线可能表明少量或没有结合的蛋白质。
13 取出未结合的上清液并将其丢弃在适当的废液容器中。
关键步骤 从试管中取出上清液，注意不要破坏磁珠。
关键步骤 在故障排除过程中，可以保留上清液并通过另一种测定法（例如，SDS-PAGE）进行分析，以检查SP3结合步骤的效率。在该上清液中应观察到很少或没有蛋白质。
14 从磁架上取下试管，加入180 μL的80%乙醇SP3冲洗液和移液器混合以复溶并冲洗珠子。
关键步骤 在移液器混合和冲洗SP3珠子时，没必要过于激烈。强力混合会导致蛋白质损失。建议使用200 μL吸头进行标准移液，在用180 μL体积的80%乙醇复溶磁珠后进行3~4次。
15 将试管放在磁架上并孵育，直到珠子迁移到管壁上。
16 取出上清液，注意不要破坏珠子。
关键步骤 上清液可以保留并通过另一种测定进行分析（例如，SDS-PAGE）作为故障排除过程的一部分，以确定漂洗步骤中的潜在损失。在该上清液中应观察到很少或没有蛋白质。
17 再重复步骤 12-16 两次，以完全冲洗与 SP3 珠子结合的蛋白质。
关键步骤 去除最后的 80% 乙醇冲洗液后，注意从试管中取出尽可能多的残留冲洗液（<5 μL 是最佳的），以避免残留到酶消化步骤中。无需将 SP3 磁珠完全风干。
18 从磁架上取下试管，加入 100 μL 含有 0.4 μg 胰蛋白酶 + rLysC 混合物的消化溶液。
关键步骤 加入消化液后，不要用移液管混合磁珠。避免粘稠SP3磁珠附着在移液吸头上，从而导致损失。
关键步骤 此处胰蛋白酶用量仅用于示例。常使用1：25（wt/wt）的胰蛋白酶与蛋白比例进行标准消化。该比率应根据样品类型进行优化。
19 使用200 μL移液器，轻轻地将未被液体覆盖的珠子沿管壁推入消化溶液中。不要尝试移液混合物。
关键步骤 如SP3磁珠加入消解液后自然复溶成溶液，则轻摇试管将所有磁珠移入液体中。不要轻弹管子。
20 如可用，在水浴中超声处理30秒以分散。如无超声水浴，则37°C和1000 r.p.m.混合孵育10分钟。
关键步骤 超声处理增强了消化前珠子的解聚。在超声仪中孵育，直到观察到珠子的分解。
关键步骤 这种预孵育可帮助分散磁珠，更易移液。然而，孵育后磁珠可能仍非常粘稠，尤其在蛋白质量很高的情况下。可延长孵育时间，以允许蛋白开始水解（如，1-2 小时），以进一步增强磁珠的重建。
21移液混合以确保珠子正确复溶，并在37°C下ThermoMixer中以1000 r.p.m.混合孵育18小时。
关键步骤 此处使用的消化孵育时间仅用于示例。较短的持续时间可成功使用，但应根据样品类型优化。
22消化完成后，将试管在20,000g下在24°C离心1分钟。
关键步骤 执行离心步骤将有助于肽回收，而不会残留微球，因为SP3微球会堵塞色谱柱。
23 将试管放在磁架上，直到珠子沉淀在试管壁上，然后将上清液移到新试管中。
关键步骤 收集上清时避免去除磁珠而干扰下游分析。重复离心（步骤22），如磁珠残留，则回收上清。
关键步骤 如果样品含有珠子，请勿继续冷冻储存。确保在储存前完全去除珠子。
暂停点 制备的肽可以无限期地储存在-80°C下。
24 继续对肽样品进行MS分析。
