SP3（single-pot, solid-phase-enhanced sample-preparation）是一种基于顺磁颗粒的蛋白质组预处理工作流程，通过有机溶剂乙醇或乙腈驱动驱动蛋白在羧基或其它亲水性磁珠表面被捕获（如图所示）。标准 SP3流程中，蛋白质通过亲水相互作用机制与磁珠结合，结合了蛋白的磁珠被束缚在溶剂化层，可冲洗去除不需要的污染物，然后在一定条件下洗脱纯化的蛋白质。这种亲水捕获机制类似于亲水相互作用色谱（HILIC）中所涉及的机制，已被广泛证明是分离多种生物分子的有效工具。利用该机制，SP3可实现蛋白质和肽的无偏回收、与大量化学物质（如洗涤剂、离液剂和盐）兼容，可在大范围的输入量上定量回收，促进自下而上的深层蛋白质组学分析。SP3磁珠是Purimag Bead专为Protein Clean蛋白组学前处理设计的高效磁珠。其独特的表面化学性质和稳定的磁性性能，使得SP3磁珠在蛋白分离、纯化等过程中表现出色。无论是小规模实验还是大规模生产，SP3磁珠都能提供高效、稳定的蛋白组学前处理解决方案。
SP3是一种简单的方案，其中所有步骤都在单管中进行，可快速完成，测试成本低。此外，其适用于机器人自动化，而无需定制硬件。由于这些优势，SP3已被用于大量蛋白质组学实验，从对单个人类卵细胞、果蝇胚胎、免疫细胞、肾和临床肿瘤组织的高灵敏度筛选，到对细胞系、其它模式生物、纯化提取物、染色质中的蛋白质-DNA相互作用以及细胞外基质混合物的深入分析，都受益于SP3方案提供的简单稳健处理。SP3方案可与许多常用的磁珠类型和表面化学相容，如AMPure（Beckman-Colter）和其它羧基或胺基的磁珠（Dynabeads carboxyl、Dynabeads amine、MagReSyn carboxyl、MagReSyn amine和MagReSyn-HILIC）。理论上，任何有亲水涂层的功能化磁珠都应与SP3兼容。SP3方案中最常使用的是Cytiva的Sera Mag SpeedBeads（GE Healthcare），提供了测定性能与成本之间最佳平衡。Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified [E7] Magnetic Particles (cat. no. 45152105050250，Hydrophilic)和Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified [E3] Magnetic Particles (cat. no. 65152105050250，Hydrophobic) 两种类型的SeraMag磁珠的专有涂层在表面亲水性方面差异微小。当在SP3中单独使用时，这两种磁珠类型提供了大致相同的性能，但可以观察到基于亲水性的肽富集效率的微小差异。使用两种类型磁珠的组合来消除任何潜在的差异，能更好保持结果的一致。
厦门普睿迈格生物科技有限公司推出类似SeraMag两种类型的磁珠SP3-H-Carboxyl和SP3-O-Carboxyl，可替代SeraMag磁珠在SP3方案中的应用。
SP3-H-Carboxyl
Cat：SP30045
1ml、15ml
Hydrophilic
SP3-O-Carboxyl
Cat：SP30065
Hydrophobic
l 概述
SP3-Carboxyl羧基磁珠是0.4 μm 磁性颗粒，表面有均匀羧基。具有快速的磁响应、高结合载量、大比表面积、高灵敏度，稳定性好，物理完整性好，反应动力学快。SP3-Carboxyl羧基磁珠磁含量为（~ 70%）。
l 典型应用
蛋白组学样品预处理SP3过程应用。
l 处理介绍
使用过程中，应控制颗粒的单分散性和均匀悬浮液，以提供稳健且可重复的性能。将 SP3-Carboxyl羧基磁珠储存在 2~ 8°C 下，如颗粒沉降，则重新悬浮。SP3-Carboxyl羧基磁珠在分子生物学中常用的较宽pH和温度范围内保持稳定，例如胍裂解缓冲液和 PCR 热循环温度。
l 重悬
颗粒不完全重悬会导致检测开发问题。超声重悬颗粒逆转由偶联反应诱导的轻度聚集。
l 灭菌
SP3-Carboxyl羧基磁珠不是无菌的。该制剂含叠氮化钠（0.05%），如防止微生物生长的防腐剂。建议在颗粒长期储存后评估细菌污染。细菌污染可以通过在适当的生长培养基上接种和在72小时后检查平板来评估。珠子可以通过用70%乙醇洗涤来灭菌。不要将珠子高压灭菌，因为这可能导致部分至严重的磁珠聚集。蛋白偶联的微珠不能灭菌。
l 化学相容性
SP3-Carboxyl羧酸盐修饰磁珠是与尿素（6 至 8 M）和 EDTA 相容。
l 防止聚合
为防止颗粒聚集，请避免以下情况：强酸性 pH 值（羧基和磺酸盐基团质子化）的缓冲液、强碱性pH值（胺基去质子化）的缓冲液、冰冻温度、加热、过度涡流、过度超声处理（特别是对于蛋白质标记的磁珠）、微生物。
蛋白质制备 ● 定时 2 小时
1 将 ThermoMixer 预热至 60 °C。
2 在 1.5 mL 试管中以 1 mg/mL 的复溶溶液制备 1 mL BSA 储备溶液。
关键步骤 如果使用需要还原和烷基化但尚未进行还原和烷基化的蛋白质混合物（例如细胞裂解物），请在此处用您的样品代替 BSA 输入并按照说明进行操作。
3 将准备好的BSA原液管在60°C的ThermoMixer中加热30分钟，以1000 r.p.m混合。
4 从热混合器中取出试管，使其在实验室工作台的架子中冷却至室温。
5 向BSA管中加入100μL的 IAA储备液来烷基化还原二硫化物，然后室温避光孵育30分钟。
关键步骤 IAA 对光敏感。溶液应新鲜制备，并在黑暗中进行孵育。
6 向BSA管中加50μL的DTT原液淬灭烷基化反应，然后室温孵育15分钟。
暂停点 制备的样品（本例中为BSA）可以无限期地储存在-80°C下。
SP3 蛋白纯化和消化 ● 定时 30 分钟 + 18 小时孵育
7 将 ThermoMixer 预冷至 24 °C。
8 在复溶溶液中将制备的10 μg（10 μL 制备的1 mg/mL 原液）BSA稀释至最终体积48 μL。
9 加入100 μg的SP3磁珠并移液混匀。这是2 μL（50μg/μL SP3）磁珠原液，终体积为 50 μL 蛋白质溶液。
关键步骤 确保溶液中SP3磁珠完全均质化。轻柔移液吹打混合。混合不当会降低SP3的蛋白质回收效率。
10 为诱导蛋白质与珠子结合，向含SP3珠子的BSA混合物中加入50 μL乙醇。短暂摇晃试管以均质化。
关键步骤 避免加入乙醇后过度摇晃混合物，尽量减少磁珠粘附在管上部而造成的损失。通过初始混合步骤完全均质化并非必需；水相和乙醇相部分整合就足够了。在下一步孵育中，将使用混匀仪完全混合。
11 将结合混合物在24°C的ThermoMixer中以1,000 r.p.m孵育5分钟。
关键步骤 避免以>1000 r.p.m.的速度混合。快速混合会导致聚集的磁珠粘附管壁，可能降低蛋白回收率。
关键步骤 观察孵育后磁珠的聚集。微珠的聚集表明蛋白质在微珠表面结合。聚集量与输入材料的数量成正比，并取决于结合条件（例如，反应体积和珠子数量）。
12 结合完成后，将试管放入磁力架中并孵育，直到珠子迁移到管壁上。
关键步骤 观察被磁架吸引时管壁上珠子的结合模式。珠子在内管壁周围分布是结合材料的良好指示。非常细的珠子线可能表明少量或没有结合的蛋白质。
13 取出未结合的上清液并将其丢弃在适当的废液容器中。
关键步骤 从试管中取出上清液，注意不要破坏磁珠。
关键步骤 在故障排除过程中，可以保留上清液并通过另一种测定法（例如，SDS-PAGE）进行分析，以检查SP3结合步骤的效率。在该上清液中应观察到很少或没有蛋白质。
14 从磁架上取下试管，加入180 μL的80%乙醇SP3冲洗液和移液器混合以复溶并冲洗珠子。
关键步骤 在移液器混合和冲洗SP3珠子时，没必要过于激烈。强力混合会导致蛋白质损失。建议使用200 μL吸头进行标准移液，在用180 μL体积的80%乙醇复溶磁珠后进行3~4次。
15 将试管放在磁架上并孵育，直到珠子迁移到管壁上。
16 取出上清液，注意不要破坏珠子。
关键步骤 上清液可以保留并通过另一种测定进行分析（例如，SDS-PAGE）作为故障排除过程的一部分，以确定漂洗步骤中的潜在损失。在该上清液中应观察到很少或没有蛋白质。
17 再重复步骤 12-16 两次，以完全冲洗与 SP3 珠子结合的蛋白质。
关键步骤 去除最后的 80% 乙醇冲洗液后，注意从试管中取出尽可能多的残留冲洗液（<5 μL 是最佳的），以避免残留到酶消化步骤中。无需将 SP3 磁珠完全风干。
18 从磁架上取下试管，加入 100 μL 含有 0.4 μg 胰蛋白酶 + rLysC 混合物的消化溶液。
关键步骤 加入消化液后，不要用移液管混合磁珠。避免粘稠SP3磁珠附着在移液吸头上，从而导致损失。
关键步骤 此处胰蛋白酶用量仅用于示例。常使用1：25（wt/wt）的胰蛋白酶与蛋白比例进行标准消化。该比率应根据样品类型进行优化。
19 使用200 μL移液器，轻轻地将未被液体覆盖的珠子沿管壁推入消化溶液中。不要尝试移液混合物。
关键步骤 如SP3磁珠加入消解液后自然复溶成溶液，则轻摇试管将所有磁珠移入液体中。不要轻弹管子。
20 如可用，在水浴中超声处理30秒以分散。如无超声水浴，则37°C和1000 r.p.m.混合孵育10分钟。
关键步骤 超声处理增强了消化前珠子的解聚。在超声仪中孵育，直到观察到珠子的分解。
关键步骤 这种预孵育可帮助分散磁珠，更易移液。然而，孵育后磁珠可能仍非常粘稠，尤其在蛋白质量很高的情况下。可延长孵育时间，以允许蛋白开始水解（如，1-2 小时），以进一步增强磁珠的重建。
21移液混合以确保珠子正确复溶，并在37°C下ThermoMixer中以1000 r.p.m.混合孵育18小时。
关键步骤 此处使用的消化孵育时间仅用于示例。较短的持续时间可成功使用，但应根据样品类型优化。
22消化完成后，将试管在20,000g下在24°C离心1分钟。
关键步骤 执行离心步骤将有助于肽回收，而不会残留微球，因为SP3微球会堵塞色谱柱。
23 将试管放在磁架上，直到珠子沉淀在试管壁上，然后将上清液移到新试管中。
关键步骤 收集上清时避免去除磁珠而干扰下游分析。重复离心（步骤22），如磁珠残留，则回收上清。
关键步骤 如果样品含有珠子，请勿继续冷冻储存。确保在储存前完全去除珠子。
暂停点 制备的肽可以无限期地储存在-80°C下。
24 继续对肽样品进行MS分析。
